§PCR等

时间段:

9:11-13:02,13:16-17:37

坐标位置:

中国泰安,山东农业大学本部国重楼417室


任务一:普通PCR

实际操作步骤:

1、体系

模板DNA:1微升

前引物(F)、后引物(R)各0.3微升

酶Mix:10微升

dH⒉O补足(即+8.4微升)

先依据每对引物的点样数配置混合体系足够量,再取19微升点样,然后+1微升模板。

中间引物,片段引物

2、跑PCR

提前预约PCR仪。

12×8的96孔板盖皮套盖,旋转。

变性94℃

退火是引物与模板结合的过程,退火温度依据所使用引物的平均Km值定,用Km-5℃,用小的那个,温度设定尽量不要低于55℃。

延伸72℃,此时Taq酶的活性最高;延伸温度时间设定有要求,拟南芥20s,水稻60s;温度编辑栏设置具体参数。

PCR基本原理

任务二:电泳

1、配制1%的琼脂糖凝胶电泳液

60mL液(可适当多加点)+0.6g琼脂

25×2孔

2、具体注意问题

带手套。

微波炉溶解至无小的晶体。

溶好后移液枪+EB,出现红色即可。

正确接好正负极,DNA在碱性缓冲液中带负电荷,外加电场向正极移动。

记得在一侧空一个格加Marker。

任务三:紫外显影

依据条带位置判断是否跑出了所需要的片断,分析结果。

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