1128 转录组分析 B站up主天马行空的坦克兵 （讲解清晰易懂）

09  删除conda下的某一款软件 删除名为rnaseq1环境下的比对软件STAR：remove -n rnaseq STAR          Ctrl+C停止运行程序  （删前删后注意查看，查看有两种，去所属环境删除与直接指定环境用命令删除）

删除名为rnaseq1环境下所有软件： remove -n rnaseq --all

10  安装mamba - conda的左右手

conda网站上搜索mamba，第一条（下载量最多）匹配出来的mamba，点进去，根据命令安装。

mamba是所有环境都可能会用到的软件，并且对整体环境无干扰，所以安装在base环境。

由于mamba基于conda而产生的，所以使用时必须是在conda激活的环境下。

mamba安装其他软件报错命令：不能打开下载文件，没有这个文件夹或者路径Couldn’t open fiel for download ...（可能是版本不匹配，直接粘贴Github反馈网址，进入看看Mamba软件更新情况，小姐姐安装了0.9.1版本（降了版本型号，结果还是不行））

11mamba安装软件报错&conda 安装软件却不报错（中）

为什么我的which STAR，不显示STAR软件的所在路径呢？但我的STAR --help能够找到.（注意软件名大小写的区别，在安装时，大小写仿佛没有区别。但是在搜索查询时，大小写要注意区分。)

安装时可以用bioconda.org官网查询匹配。

11mamba安装软件报错&conda 安装软件却不报错（下）

作者尝试，退出rnaseq环境，进入base环境，新建一个环境，将mamba安装在新环境下。激活新环境（换环境尝试，报错依旧）

删除环境时，必须注意要退出该环境，再进行删。

mamba安装再base环境下，先退出base，再remove -n base mamba(删除名为base环境的mamba软件)

再次尝试（无效）：解压mamba文件 tar zxvf mamba.gz ./ (无效)，拷贝cp app ~/miniconda3 -r； 移动当前文件夹所有文件到上一级文件夹下 mv ./* ../ -r （有空的文件夹，不能拷贝）

11 mamba安装软件成功案例（最终）---结果作者还是报错了 ，报错命令conda has prepared the above report

12conda或者mamba安装软件经典报错 HTP000 CONECTION FAILED,HTTP error(经典网络不行的报错)

13conda安装软件报错 An unexpected error has occured, conda has prepared the above report. 可能安装的软件与python版本不匹配，最好改变安装软件的版本，因为python包（Python包是基础配置包）一变，可能会导致其他版本不能用。中等新建新环境，安装匹配的python版本（麻烦，得反复调用），最次直接在原环境直接更改python版本。

查看版本conda list或  软件名 -V。

[if !supportLists]14. [endif]conda 安装的两个软件是“欢喜冤家”不能共存，其实就是版本没找对（更新或者降低版本）（版本号要相互对应，要先安装一个包，再按另一个包，才能使用）

那怎么找是否兼容（依存）呢，怎么安装呢

怎么找对版本：去官网查看有无depend（依存）关系；此外可以运用mamba repoquery denpends 包名 命令去查询依赖关系（谁依赖mamba） mamba repoquery whoneeds python(谁需要某某软件)

怎么安装：---技能三：利用conda安装最新版本mira和mitbom （参考博主此个视频，能够解决不兼容问题。）

15借助conda软件安装报错，出现GLIBCXX_3.4.22 not found问题（安装上了，为啥查找不到）---软件库新建链接就行（见up主，fastp软件系列2与3，解决这个问题）

（命名安装不了，弹不出帮助文档）-----（可能是软件名大小写问题），想要弄清大小写，去万能的官网搜 anaconda.org/search（但是注意官网与服务器大小写不统一，如star，官网小写，但是在服务器是大写的；此外注意服务器中每个字母，每个空格都有特定的意义，不能大意）

小思考：(可以考虑做一款推荐版的视频，每个软件应该安装什么版本，安装的顺序----这种效果应该会非常不错--自己会了之后做这个---up主在第16节就进行了推荐，安装的话可以借鉴他们实验室的流程)

16转录组分析—总结自己Linux上常用的转录组版本软件

安装的时候，名称用trim-galore，查询的时候，软件名称是用trim_galore

可以强烈借鉴作者的各种软件版本。那样不会存在版本问题。

17批量下载ebi中的fastaq/SRA数据

准备数据:GSE155902(自身必须根据作者的路程演示一遍***,跟着up主做一遍，可以思考不断的做PPT进行输出)

（选择原因：该组数据分组明确，样本量较少，便与演示，文章中清晰展示过程，并给出了原始数据----可以自己演示进行比较）

挂在后台下载NCBI中的数据

nohupwget -c 链接 &（）368302是其名称

下载位置：批量下载的话可能下载在家目录下的NCBI处

Kill 368302（结束进程）

取消下载则先删除文件rm SRR12415656 ,接着取消后台下载rm nohup.out

Sra的格式需要用个软件转换成FASTAQ格式，不如利用EBI网站搜索转换，直接下载FASTAQ格式

批量下载（基于文件命名有顺序，所以利用for循环指定范围进行批量下载）】

for循环展示：for i in {1..100}  （展示1-100，并用空格隔开）

> do echo -ne “$i ”(-ne数字与数字之间以空格隔开)

> done

批量下载命令：

如for i in 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63  ; do

>{

> nohup wget -c ftp: //ftp.sra.ebi.ac.uk/voll/fastq/SRR124/0${i}/SRR124156${I}/SRR124156${i}_1.fa stq.gz &

>}

>done

Ctrl+P键可以显示之前输入的命令，Ctrl+N键可以显示下一个常用命令； tail -f nohup .out（可以查看下载进度）

18 解读转录组测序下机数据&fastaq文件，到手的下机数据、利用linux查看fasta文件

一查看什么（测序信息）

查看每个下载数据内部内容，每一行代表什么

zless SRR12415652_1. fasta.gz |head -n 8(只查看该数据集的前8行，up主打算精心讲解其组成)

ATCG表示通过红黄蓝绿荧光进行修饰的，N代表没有读出荧光颜色，不知道碱基组成。

zless SRR12415652_1. fasta.g 不用管道部分（想看多少看多少）

数据集的内容组成由4行4行的循环格式组成，每一个4行代表

4行中第一行代表的是测序信息（啥样本（样本名称）啥仪器啥泳道啥流动池啥line啥tiel，啥X/Y，最末尾的1代表第一个reads）

行中第二行代表的是碱基顺序（如果含N太多的话，需要质控修建掉吧）

第三行代表的是+号（一般没有内容，有内容也基本与第一行一样，但是+号必须保留）

第四行代表（第二行每一个碱基的质量值，代表相对应碱基的ASC‖码）ASC‖码有phred33与phred64码，目前主要是用phred33，反映碱基质量。

19 解读转录组测序下机数据&fastaq文件（同18）

20转录组分析——怎么才能知道下载的fastq文件是否完整--md5sum（校验码）文件轻松搞定

用md5sum *gz >md5.txt（将当前位置所有md5sum *gz文件写入md5.txt文件，目录下会多一个md5.txt文件，可以用md5查看文件完整性）---- cat md5.txt（可以比对公司的或者网站数据库提供的，确认数据是否被改动或者有缺失）  md5sum -c md5.txt（可以用于反馈下载数据是否完整）

21转录组分析  ---对GSE155902批量fastQC质控

检查完数据完整性之后，进行质控，质控利用fastQC软件，一般都是批量进行质控

查看当前文件夹下有多少格文件ls |wc -l

[if !supportLists]一、[endif]先展示单个进行质控

激活安装软件的小环境conda activate fastQC

接着开始质控fastqc -t 2 SRR12415652_1.fastq.gz(-t 2代表的是两个线程，跑的可能稍微慢些)

ls质控之后，会生成一个SRR12415652_1.fastq.html（网页），可以下载该网页进行查看，每次质控，都会生成一个zip

二、批量质控

用通配符ls *gz |xargs fastqc -t 5

避免一个一个点开相应的html进行查看（上百个不得点死，所以multiqc来了），可以将各自的html打包成一个html总文件进行查看

用multiqc ./（直接汇总生成multiqc的html）

可以下载到桌面进行查看，也可以用软件进行查看。

22转录组分析---对GSE155902批量trim_galore质量控制

创建一个名为rawdata_qc的文件mkdir rawdata_qc

将所有html、zip文件都放在该文件夹下mv *html ./rawdata_qc

mv *zip ./rawdata_qc/

mv multiqc_data/ ./rawdata_qc/

创建一个文件rawdata

把所有gz结尾文件放入该文件夹下 mv *gz ./rawdata

ls

cd rawdata

用原始数据进行质控（所有相应操作必须要有相应软件---trim_galore安装之前，必须先安装cutadapt）

批量进行处理（原始数据质控处理）

用ls *_1.*gz>1  （把1结尾的文件写成1结尾的文本文件）

用ls *_2.*gz>1  （把2结尾的文件写成2结尾的文本文件）

paste 1 2 > config   (把1与2并排排列，整理在一个文件夹下)

Mkdir cleandata cleandata_qc（建立cleandata文件与其质控文件）

用dir=”./cleandata”(指定输出路径)

用cat config |while read id               (读取列表)

do

arr=${id}

fq1=${arr[0]}

fq2=${arr[1]}

nohup trim_galore -q 25 --phred33、64

23 转录组分析录屏 ---对trim_galore质控后的fastq文件fastqc一下，看一下质控效果

进入质控完的结果的目录下

cd cleandata后将cleandata_qc放在cleandata下（原始文件gz结尾，质控文件fq.gz结尾）

测序长度，由于后续重复较高，设置为20-100，20太低了，所以up主将其调为

质控效果不好，所以作者打算重新进行质控

找几篇文章看看转录组测序数据质控结果怎么阅读？明白fastqc与multiqc处理之后，结果的阅读方式。

24 转录组分析——trim_galore软件的使用方法（讲解质控文件trim_galore的帮助文档）

[if !supportLists]1- [endif]conda avcivate rnaseq

[if !supportLists]2- [endif]trim_galore(想用必须安装cutadapt)

[if !supportLists]3- [endif]trim_galore利用trim_galore --help查看该软件的使用说明，-q（保证每一个碱基的之质量，默认是20，up主一般用25）； -phred33 （sanger测序1.9的话就是ASC‖+33，其余则是64（普遍是33型）； --fastqc （运行FastQC，产生FastQC文件）； 实在不行可以运用百度搜索例子。--stringency（接头序列重复不能超过一个.?不大理解该含义） -e(错误率设置为0.1)  --length（长度默认20，太短的话比对序列会显著增加）  --max n （最多允许几个n出现）  --trim-n（去除n碱基）

[if !supportLists]4- [endif]trim_galore -l 25 -stringency 3 -q 25 --phread 33（碱基长度设置为25，接头重复不能超过3否则会被删除，碱基质量值要大于25， ASC‖碱基质量评估类型）  需要什么参数，按照help文档进行添加即可。

哎，作者又断了，算了，把作者相应的技能视频也先学了把。