核酸（nucleic acid）在生物界中堪称主宰，是一类非常重要的生物大分子，它在生物的繁衍、发育、维持、衰老和死亡等一切生命活动中扮演着重要的角色，如果其结构出现稍许的变动，比如一个碱基的差错、缺失或增加，就有可能导致突变、缺陷或疾病的出现，所以核酸已成为生物化学、遗传学以及其他有关生命学科的热门研究课题，其覆盖面之广、进展之速为其他学科所望尘莫及。而进行核酸研究的第一个前提就是能够将核酸从众多纷繁复杂的生物大分子中提取出来，并纯化到一定程度，以便进行相应的科学研究和实际应用。核酸，快到“管”里来系列共分六期来和大家共同分享一下核酸提取样品制备、提取方法及检测方面的知识，以期能够对大家的科研有所帮助。本期和大家分享的是RNA提取相关的知识点，不足之处请多多包涵。

1、RNA是什么

核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶。

2、RNA有哪些种类

在细胞中，RNA种类繁多（具体见下面模式图）。根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA、rRNA，以及mRNA。mRNA是依据DNA序列转录而成的蛋白质合成模板；tRNA是mRNA上遗传密码的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的部分，而核糖体是蛋白质合成的场所。

细胞中还有许多种类和功能不一的小型RNA，像是组成剪接体（spliceosome）的snRNA，负责rRNA成型的snoRNA，以及参与RNAi作用的miRNA与siRNA等，可调节基因表达。而其他如I、II型内含子、RNase P、HDV、核糖体RNA等等都有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类RNA被称为核酶。

3、RNA提取的原则

1. 保证RNA一级结构的完整性；

2. 提取的RNA样品中不应存在对酶存在抑制作用的有机溶剂及过高浓度的金属离子；

3. 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

4. 排除其它核酸分子（DNA）的污染。

4、常用RNA提取方法

（一）TRIzol法

1. TRIzol裂解液主要成份及其作用

TRIzol主要成分：苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性。异硫氰酸胍是强有力的蛋白质变性剂，既能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离，又对RNA酶有强烈的变性作用。至于TRIzol试剂的颜色，通常为粉红色，其作为一种指示剂，为了使抽提后分层更好区分。

2. 氯仿在RNA抽提过程中的作用

苯酚对蛋白质的变性作用远大于氯仿，但是酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含RNA的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；另外酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提，抽提后仍有大量的酚溶解到水相中，其会抑制后续的酶促反应，因此单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。

组织匀浆后加氯仿分相时，因TRIzol试剂pH<5.2，则DNA优先分配于有机相，水相则是RNA，组织蛋白以及部分核蛋白+大片段基因组变性以沉淀形式形成中间相。

3. 不同沉淀剂的作用原理及应用

异丙醇沉淀原理是降低了介电常数，破坏了了核酸分子表面的水化层。另外还可以利用等电点法和盐析法沉淀，如利用醋酸钠（3M，pH5.2），一方面高盐浓度破坏核酸分子水化层，另一方面使其接近核酸等电点（核酸的等电点比较低，如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5）。

乙醇和异丙醇相比，因为两者化学性质都是醇类，沉淀原理是相似的。异丙醇沉淀法一般不需要等温放置很长时间；其缺点是易使盐类与核酸共沉淀，而且异丙醇难以挥发除去，必须用75%乙醇洗涤；无水乙醇沉淀沉淀的盐少，且易挥发除去；缺点是总体积较大，需要阳离子如Na离子的存在，并且加2-2.5倍体积的无水乙醇，需在-20℃放置很长时间，30分钟-1小时。

乙醇/异丙醇沉淀的方式能够使不同分子量大小的RNA均沉淀下来，适合所有RNA建库项目。对于预期浓度较低的样品，可适当加入醋酸钠、糖原或线性丙烯酰胺等助沉剂；氯化锂不能有效沉淀小分子量的RNA，故不适用于小RNA建库项目。

（二）TRIzol+过柱法

核酸纯化柱（Spin column）可以用于各种材料的DNA\RNA的提取以及精制。具有操作简单、回收率高、性能稳定等特点，目前产品已经为国内外大多数实验室和公司使用。核酸纯化柱（Spin column）采用硅胶膜作为核酸的特异性吸附材料，而对其他生物材料基本不吸附，可以保障最大程度地回收样品中的DNA\RNA，同时去除其他杂质。对于杂质组份不清楚，杂质含量较多的样品，可考虑采用TRIzol裂解，氯仿抽提，然后过柱纯化的方式进行提取，一般可显著改善提取样品的纯度。

（三）CTAB+过柱法

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子型表面活性剂，可溶解细胞膜使细胞裂解。在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl），CTAB可与蛋白质和中性多糖形成复合物而沉淀，不能沉淀核酸和酸性多糖。对于果肉、果皮等富含多糖多酚且较难裂解的样品，可采用CTAB裂解液在55℃条件下进行裂解，再以过柱的方式进行纯化，一般可得到纯度及完整性都很理想的RNA样品。

（四）试剂盒法

现在市面上有用于各种植物、动物、微生物的RNA提取的试剂盒。像QIAGEN、天根、艾德莱等国内外厂家，均有不同应用方向的提取试剂盒可供选择，且质量较佳。但在具体工作中需要注意的是，使用时一定要根据自己的实验需要购买专用提取试剂盒，如果不是专用试剂盒，或许能提出RNA，但不能确保其质量以及完整性，会影响RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real time RT PCR、芯片分析、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析、分子克隆等后续实验的结果。

本篇至此分享完毕，同DNA提取一样，需要强调的是RNA提取方法及策略并不是一成不变的，在实际的工作中我们可以根据所提取材料的不同、提取结果的差异灵活调整实验方案，目的只有一个，提取到纯度高、完整性好、得率高的RNA样品，以满足我们后续的科研需求