血浆蛋白质组学分析发现与上尿路尿路上皮癌相关的分子特征

Plasma proteomic profiling discovers molecular features associated with upper tract urothelial carcinoma.Cell Reports Medicine （2023） (IF=14.3/Q1).

摘要

上尿路尿路上皮癌(UTUC）通常诊断较晚，预后不良。关于用于疾病监测的潜在非侵入性生物标志物的数据有限。作者研究了362名 UTUC 患者和239名健康对照者血浆的蛋白质组学特征。提出了一种综合的组织-血浆蛋白质组学方法来推断用于识别肌层浸润性MI-UTUC 患者的特征蛋白。研究发现了一个反映淋巴结转移的蛋白质panel，这对于识别高风险和预后不良的UTUC患者很有意义。研究还确定了一个十种蛋白质分类器，并建立了一个预测UTUC患者无进展生存期的进展时钟。最后，通过在独立队列中的平行反应监测测定进一步验证特征蛋白。总的来说，这项研究描绘了UTUC队列的血浆蛋白质组学景观，并为UTUC的进一步生物学和诊断研究提供了宝贵的资源。

思维导图

结果

1. 患者血浆蛋白质组分析

UTUC 定义为由输尿管 （UUC） 或肾盂 （RPUC） 引起的尿路上皮癌。作者在UTUC发现队列中纳入了163例RPUCs、170例UUCs和29例两种癌症的组合。RPUC或UUC患者或两者兼而有之的基本特征（年龄、性别和吸烟史）相似。在所有血浆样品中共鉴定出9,336个蛋白质组，每个UTUC和正常血浆（健康对照）样品平均分别有1,860和1,789个蛋白质组。蛋白质组是高度动态的，通过蛋白质丰度（FOT）测量的大约两个数量级。在UTUC血浆中鉴定出的被注释为细胞外基质或位于细胞外空间中的蛋白质数量与正常血浆中没有显着差异。有趣的是，在UTUC中发现的注释为癌症相关蛋白质并与美国食品和药物管理局（FDA）批准的药物相关的蛋白质数量略高于正常血浆。

2. UTUC和正常样品的血浆蛋白质组谱

将UTUC患者的血浆蛋白质组谱与健康对照组进行比较发现550个显着差异表达蛋白（DEP），其中307个蛋白质上调，243个蛋白质下调。DEPs的通路富集分析表明，正常富集的蛋白参与受损嘌呤的裂解、去泛素化和硫代谢，而UTUC血浆中富集的蛋白主要参与转移RNA（tRNA）氨酰化、脂肪酸降解和急性期反应通路。在UTUC血浆蛋白质组中鉴定的8,923种蛋白质中，有234种是由人类蛋白质图谱（HPA，https://www.proteinatlas.org）注释的肾脏组织特异性蛋白质。UTUC和正常血浆样品之间的差异蛋白分析导致鉴定出46种肾脏组织特异性蛋白。使用这些差异蛋白的进一步通路富集分析表明，UTUC富集的蛋白质参与脂肪酸代谢通路，而在正常样品中富集的蛋白质主要参与细胞钠离子稳态。这些表明，这些癌症相关蛋白质泄漏到血浆中可能会影响血浆组成。

进一步比较了UTUC患者的血浆蛋白质组谱与UTUC组织蛋白质组的血浆蛋白质组谱。 在UTUC组织和血浆样品中通常定量了7,913种蛋白质，并证实了UTUC组织和血浆的蛋白质组之间的显着正相。165 种蛋白质在血浆蛋白质组和组织蛋白质组中UTUCs中上调，富集了核因子κB信号转导的正调控、药物反应和内吞作用。作者还发现UTUC组织和血浆的蛋白质组之间存在差异。结果显示，有234种蛋白质仅在UTUC血浆蛋白质组中显著上调，主要富集蛋白水解和细胞粘附途径。为了探索血浆增强蛋白，作者进行了监督分析以过滤血浆蛋白, 其中21种蛋白质符合标准，其中 9 种是癌症相关蛋白。根据 HPA 数据集，在 9 种蛋白质中，CTSB、S100A8、HP 和 CHI3L1 与尿路上皮癌的不良预后相关。值得注意的是，UTUC 血浆中 CTSB 和 S100A8 的上调分别参与蛋白水解和细胞粘附途径。CTSB的过表达可促进结直肠癌、肝癌、胃癌、胶质瘤和卵巢癌的细胞侵袭和转移。采用基于DEP 的逐步逻辑回归来识别可以区分 UTUC 和正常（称为 UTUC/normal-sig）的蛋白质子集。基于 UTUC/normal-sig 蛋白，应用了 10 x交叉验证，ROC-AUC为 0.942。使用 DIA 定量蛋白质组学在另一个独立验证队列 （n = 89） 中进一步评估的模型的性能，其中 AUC 为 0.925。综上所述，分类器模型可以代表识别UTUC患者的潜在预测模型。

3. 血浆蛋白质组谱和尿液蛋白质组谱之间的区别

尿液是分析局部疾病的良好来源，也是发现肾脏和泌尿生殖系生物标志物的理想来源。作者收集了9 名 UTUC 患者（T1 [n = 2]、T2 [n = 4]、T3 [n = 3]）和 5 名健康对照的尿液样本，并进行了蛋白质组分析。在所有尿液样本中共鉴定出5,898个蛋白质组，UTUC的每个尿液样本平均有2,042个蛋白质组，正常尿液样本平均有2,203个蛋白质组。在UTUC和正常样品中鉴定出的蛋白质数量为3,488。与健康对照组相比，UTUC患者尿液中293种蛋白上调，387种蛋白下调，在DEPs中，56个上调蛋白和71个下调蛋白是尿外泌体蛋白。进一步比较了UTUC的尿液蛋白质组谱与UTUC血浆蛋白质组的尿液蛋白质组谱。与正常样品相比，血浆蛋白质组和尿液蛋白质组中 UTUC 样品中上调的 29 种蛋白质富含 tRNA 氨酰化和蛋白水解途径。当合并UTUC样本时观察到UTUC血浆，UTUC尿液和UTUC组织中有六种蛋白质上调，将这六种蛋白质定义为潜在的UTUC增强蛋白，这可能是UTUC的指标。这六种蛋白质中有五种与我们之前报道的 UCB 队列的预后相关。这六种蛋白质中有四种在尿路上皮癌样本中显示出中度至强肿瘤染色，而另外两种蛋白质在HPA中显示出低染色，值得进一步研究。

为了探索尿液中用于NMI-UTUC诊断的特征，作者比较了NMI-UTUC和健康对照者尿液中鉴定的蛋白质。结果显示，在NMI-UTUC尿液样本中鉴定出1,254种蛋白质，其中37种蛋白质仅在NMI-UTUCs的尿液中鉴定出。尿液中的37中蛋白中有15种蛋白仅在少于10%的NMI-UTUCs血浆样本中观察。这15个蛋白中的三个蛋白RALB, FRY,和WDR45B 未在MI-UTUC中检测出，仅在NMI-UTUC尿液样本中检测到的三种蛋白质可能与NMI-UTUC疾病有关，这可以在未来的更大队列中进一步验证。

4. 血浆蛋白质组谱和EV蛋白质组图谱之间的区别

肿瘤来源的外泌体参与不同癌症过程的形成和发展，包括肿瘤微环境重塑、血管生成、侵袭、转移和耐药性。在这项研究中，作者还从60份血浆样本中分离出 EV，包括 33个UTUC 和 27个健康对照，以探索UTUC相关的EV 蛋白。常规的外泌体标志物可在血浆来源的 EV 中检测到。所有EV样品的无标记MS定量测量得到3,628个蛋白质组，每个UTUC样品平均有1,126个蛋白质组。其中，3,401蛋白（93.7%）先前已通过人类外泌体蛋白质组学研究鉴定。为了了解UTUC相关EV蛋白的特征和组成，我们试图确定UTUC患者的血浆中存在哪些蛋白质。在UTUC发现队列中，超过30%的血浆样本中鉴定出2,022种蛋白质，其中1,207种（60%）也在EV中检测到。进一步关注了UTUC血浆样本和正常样本之间的550个DEP。与 EV 蛋白质组相比，在 EV 中鉴定出298个DEP，其中187个蛋白上调，111个蛋白下调。血浆蛋白质组中的DEPs可以在EV蛋白质组中检测到;然而，这些 DEP在 EV 蛋白质组中的正常样品和 UTUC 样品之间不一定有显着差异。

通过比较 UTUC EV 与正常 EV 的蛋白质组来鉴定 UTUC EV 中上调的蛋白质。在 283 个DEP 上，其中 142个蛋白质上调，141个蛋白质下调，通路分析表明，富含UTUC的EV蛋白参与细胞粘附、细胞迁移以及补体和凝血级联反应，而富集正常的EV蛋白主要参与细胞氧化解毒和蛋白酶体。将UTUC EV蛋白质组与UTUC血浆蛋白质组进行了比较。UTUC血浆蛋白质组和匹配的EV蛋白质组均鉴定出2,200个蛋白质，占EV样品中鉴定蛋白质的69.8%。其中，在血浆和EV样品中分别观察到299和260个DEP。在UTUC血浆和UTUC EVs中，有18种蛋白质上调，而9种蛋白质下调。18 种在 UTUC 血浆和 UTUC EV 中上调的蛋白质可能作为 UTUC 患者的潜在特征蛋白。

5. RPUC 和 UUC 样品的血浆蛋白质组谱差异

UTUC 定义为由输尿管 （UUC） 或肾盂 （RPUC） 引起的尿路上皮癌。为了研究RPUC和UUC之间的异同。首先对RPUC、UUC和正常样本进行了相关性分析。与正常样品相比，RPUC中鉴定的蛋白质频率与UUC的相关性更密切。比较了 UTUC 患者与 RPUC 和 UUC中的正常样本之间具有显着差异表达的蛋白质。鉴定了 580 种蛋白在 RPUC 中上调，其中 375 种 （64.6%）蛋白在 UUC 中也上调（占 UUC 中上调蛋白的 66.5%），且主要富集在要富集脂肪酸降解和细胞增殖通路。在375种通常上调的蛋白质中，有24种与预后有关，例如ACDAS和PPP1R9B。这些结果表明，与正常血浆样本相比，RPUC和UUC血浆样本中大多数失调的方向是一致的。

UUC的预后比RPUC差，这表明UUC和RPUC具有不同的分子特征和临床特征。在研究的队列中，临床信息显示 RPUC 和 UUC 患者基本特征相似，此外 RPUC 的肿瘤大小显着更大。RPUC和UUC 差异表达蛋白分析发现284个蛋白差异表达，HPA 数据集注释的肾脏增强蛋白（例如 ACSF2、DDAH1、MSRA）在 RPUC 血浆样本中上调。RPUC样品中上调蛋白的通路富集分析富集了细胞生长、脂肪酸氧化和过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路的调控，而UUC样品中上调的蛋白主要参与细胞间粘附、Hippo信号通路和丝裂原活化蛋白激酶级联反应。参与细胞间粘附的蛋白质和 Hippo 信号通路（如 CD93、DBN1和 YAP1）与临床结果相关。

6. 血浆蛋白质组学谱可识别肌层浸润性 UTUC 患者

肌层浸润性MI-UTUCs预后极差。NMI-UTUC和MI-UTUC之间的差异血浆蛋白分析结果为42个DEP。DEPs的通路富集分析表明，MI-UTUCs富集的蛋白参与急性期反应、tRNA氨酰化和脂肪酸降解，而NMI-UTUCs富集的蛋白主要参与硫代谢和去泛素化。NMI-UTUC 和 MI-UTUC 之间 DEP 的差异, 观察到一些仅在NMI-UTUCs或MI-UTUCs中表达的血浆蛋白（例如ABLIM3、SCGN、PYGO2），需要更多验证。使用最新发表的116名UCB患者的蛋白质组学数据分析，发现两种蛋白质（TST和HPCAL1）在血浆和组织样品中显著差异。威尔康奈尔医学院 （WCM UTUC） 队列中 MI-UTUC 和 NMI-UTUC 组织样本中 TST 和 HPCAL1 RNA 表达水平与本研究分析结果一致，HPCAL1 被证实在 MI-UTUC 组织样本中过度表达，而 TST 在 NMI-UTUC 组织样本中过度表达。采用逐步逻辑回归来鉴定区分 NMI-UTUC 和 MI-UTUC 的蛋白质子集（称为 NMI/MI-sig）。使用不同的训练及测试数据百分比组合，均获取较好的ROC-AUC值。总之，分类器可以作为区分MI-UTUC和NMI-UTUC的潜在预测模型。

7.与蛋白质组学特征相关的临床特征

使用单因素cox回归评估每个因素与肿瘤学结局之间的关联，结果发现血浆纤维蛋白原（FIB）是常规凝血参数，与总生存期（OS）差和PFS差相关。FIB血浆蛋白质组相关性分析获得一个包含 883个蛋白质和 55个连续临床变量的数据矩阵。将所有变量相互关联，然后进行分层聚类，生成了具有四个主要聚类（聚类 1-4）的关联图。不同的簇注释通路富集分析。使用相同的蛋白质和连续的临床变量进行加权基因相关网络分析（WGCNA），产生4个模块。通过血浆蛋白质组分析量化的FGG、FGA和FGB是与FIB相关性最强的蛋白质，这证明了血浆蛋白质组学数据的可靠性。参与炎症（SAA1、CRP 和 SAA2）和细胞迁移（ITGB2）的蛋白质与 FIB 呈正相关。这些蛋白质的高表达水平与不良预后有关。通路富集分析表明，与FIB显著正相关的蛋白质（n = 250）富集在血小板活化、急性期反应和细胞迁移通路中，而与FIB显著负相关的蛋白质（n = 139）富集在细胞氧化剂解毒途径中。FIB升高与淋巴结受累（LNI）显著相关，但相关性较弱，为0.12。为了鉴定更能预测LNI的蛋白质，我们将所有定量的血浆蛋白直接与LNI相关联。我们根据与 LNI 高度正相关的 14 种蛋白质为我们的样品生成了 LNI 评分，LNI评分显示相关性为0.41，优于FIB的0.12弱相关性。蛋白质组与淋巴结转移相关，这对于识别高危和预后不良的UTUC患者具有重要意义。

8. 机器学习识别的UTUC患者的进展时钟

为了筛选存活相关蛋白，我们确定了PFS与蛋白表达水平之间的相关性。结果显示，461 和 365 种蛋白质与 PFS 呈显著正相关和显著负相关。与PFS呈显著正相关蛋白主要与急性期反应、细胞粘附和蛋白转运途径相关。构建了单因素Cox风险模型来过滤与PFS显著相关的蛋白质。随后用lasso-cox回归从93 种蛋白质中成功选择了10个高度相关的蛋白质。每种蛋白质与PFS之间关联的森林图。接下来测试了血浆样本数据是否可以用于预测蛋白质模型，以预测UTUC患者的进展时间。对于PFS评分的进展时钟工作特征分析，1年、3年和5年的AUC分别为0.742、0.816和0.877。预测 1 年、3 年和 5年生存概率在队列中表现良好。独立队列 （n = 89） 中进展时钟模型的准确，1、3 和 5 年的 AUC 分别为 0.812、0.880 和 0.905。与进展相关的血浆蛋白特征是一种潜在的预测模型，可以根据 UTUC 患者的血液样本预测进展时间。

结论

在这项研究中，我们捕获了UTUC患者血浆蛋白质组的变化，这些变化与潜在疾病的病理特征和临床表现有关。我们证明了血浆蛋白质组分析能够发现与疾病相关的分子特征，这可能对疾病管理的重要方面产生重大影响：（1）诊断分类器可能有助于诊断UTUC，（2）潜在的预测模型可以区分MI-UTUCs和NMI-UTUCs，以及（3）进展时钟可以提供有关疾病进展的信息。