NGS003 NGS接头

我们在测序的过程中,需要构建含有接头序列的文库分子,对于我们大部分实验人员来说,只是知道接头连接是如何操作,但是对于接头的作用及结构可能并不太清楚,以illumina文库为例,完整的文库分子需含有与flowcell芯片上锚定的oligo互补序列(P5/P7 tail),index,测序引物读取位点,index引物读取位点,可能还会有UMI序列,详见下图

完整文库结构

接下来我们对接头的分类进行介绍,其实之前的笔记也有提到部分,请参考:测序基础介绍-illumina测序

    1. 根据Index位置可以将接头分为单端Index接头和双端Index接头。单端Index接头指的是仅在P5端或P7端存在Index(一般在P7端),双端Index接头指的在P5和P7端均存在Index。


      IDT单端及双端接头
  • 2.根据接头是否匹配PCR free建库可以将接头分为长接头和短接头。长接头又称为完整接头,包括P5/P7+Index序列+Read 1/2,完整接头通过TA克隆的方式连接到DNA片段之后,可不进行PCR扩增反应直接上机测序(DNA量足够上机测序时可直接上机,当DNA量不够时还需进行PCR扩增使得产物达到一定的量方可上机测序)。短接头通过TA克隆方式连接到DNA片段上后,必须与短接头互补的引物进行PCR扩增,扩增产物就是包含完整接头的DNA片段。也即短接头最终一定要通过PCR扩增成为完整接头才能上机测序


    IDT 长接头

    IDT短接头
  • 3.根据适用的平台不同,接头也是不同,本篇仅对illumina及MGI平台接头进行介绍
    3.1 Illumina接头
    https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html
    IDT 接头序列(illumina)

    3.2 MGI接头
    https://www.mgitech.cn/download/files/?q=%E6%8E%A5%E5%A4%B4
    华大MGI平台单端index接头序列详见下图:
    华大接头序列
    1. 接头修饰
      以Illumina平台的Y型接头为例,两条DNA链,一条5’端磷酸修饰,一条3’端几个碱基一般带有硫代修饰,标记为TCT或TC*T。
      接头序列及修饰

      硫代修饰是为了防止末端的Overhanging T碱基在连接的过程中被体系中的核酸酶“误伤”;5’磷酸修饰主要功能是A-T连接的过程中形成磷酸二酯键。
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