单细胞测序&空间转录组，双剑合璧，谁与争锋
编辑：ANIMUS
校对：ANIMUS
编者按：2020年初一场猝不及防的新冠肺炎疫情彻底改变了这个世界，也改变了我们每个人的工作和生活。传染性呼吸系统病毒和疾病从未真正停止过，比如2003年的SARS，2015年的MERS和2020年的SARS-CoV-2。对于呼吸道感染相关病原菌及其宿主免疫机制的研究对于基础科研和公共卫生具有重大战略意义。
爱丽慕斯学术团队专注于生命科学和医学前沿进展，探索心脑血管疾病和癌症等的致病基因、发病机制和药物开发等。这里解读应用单细胞测序和空间转录组技术，研究流感病毒感染肺组织的免疫分子机制，助力呼吸系统疾病前沿进展共享。
严重呼吸道感染可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。目前尚无有效药物可改善ARDS患者预后。宿主炎症反应限制了病原体扩散并最终清除病原体，但免疫病理反应也导致了组织损伤和ARDS。呼吸道感染是导致疾病和死亡的主要原因。这些感染可导致ARDS并发肺水肿和缺氧，导致轻度到重度呼吸衰竭。病毒感染引起的肺损伤主要是由于免疫细胞浸润，它杀死了感染细胞和周围正常细胞。因此，深入研究病原体清除和免疫病理之间的平衡，可能有助于寻找改善ARDS2预后的策略。
2020年10月28日，Nature在线发表了由美国田纳西州孟菲斯市圣犹大儿童研究医院免疫学系Paul G. Thomas和Jeremy Chase Crawford，与广州医科大学第一附属医院广州呼吸健康研究所钟南山院士合作的文章，“Exuberant fibroblast activity compromises lung function viaADAMTS4”，利用10X单细胞测序，结合空间转录组，揭示了过度的成纤维细胞活性通过ADAMTS4损害肺功能，并提出ADAMTS4可作为病原菌感染的治疗靶点。
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一、甲流病毒感染小鼠后CD45-细胞的单细胞基因表达谱
研究者采集了感染甲流病毒0天、1天、3天和6天的小鼠肺组织，分选CD45-细胞进行单细胞测序，鉴定到三个主要细胞群：成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞(图1 a&b)。病毒mRNA的高表达，表明细胞受到高效感染，主要出现在I型肺细胞,纤毛上皮细胞和II型肺细胞。
成纤维细胞在感染后出现多种转录状态(图1c, d)。为评估每个簇中激活的通路，进行基因集富集分析(GSEA)，将每个簇与感染前基线簇(簇5)比较(图1c)。根据基因表达特点，鉴定了三个主要功能：静息（resting）、ECM合成和炎症(图1c)。ECM成纤维细胞(ESFibs)中富集到编码ECM结构蛋白的基因，但缺乏炎症信号相关基因的表达(图1d)。炎性成纤维细胞高表达炎症相关基因，而静息成纤维细胞没有显著富集通路，主要涉及炎症反应或ECM合成(图1e)。
在炎性成纤维细胞中，鉴定出两种不同的激活状态，损伤反应成纤维细胞(DRFibs)和干扰素反应成纤维细胞(IRFibs)(图1d)。最后通过分析五个人肺组织活检发现人成纤维细胞活化状态与小鼠的类似。
二、谁在调控成纤维细胞激活？
为寻找调节成纤维细胞激活的上游刺激因素，作者研究了人季节性病毒(H3N2)或禽流感病毒(H5N6或H7N9) 体外感染正常人支气管上皮细胞(NHBEs)是否足以在共培养的人肺成纤维细胞中，产生一系列炎症反应(图2a)。NHBEs感染后诱导了成纤维细胞中大量炎症基因表达，包括编码细胞因子的基因(IL6)和几种基质蛋白酶(ADAMTS4,MMP3和MMP13)。作者还关注了单个细胞因子和流感病毒在其自身培养的呼吸道细胞中引发的这些炎症信号 (图2a，单培养)，并将它们与流感病毒感染者的鼻腔清洗细胞(主要包括免疫细胞)进行比较。与NHBEs相比，成纤维细胞对IL-1细胞因子家族和TNF的刺激反应强烈，ECM相关基因广泛上调(图2a)。洗鼻细胞中ECM相关基因结构蛋白和基质蛋白酶低表达。
然而，鼻洗液和上皮细胞也表现出IL1A、IL1B和TNF高表达，表明它们可能向成纤维细胞传递免疫信号，从而调节ECM相关基因表达。
a，相对于mock对照组，感染组中基因表达（log2转换后）平均变化倍数。共培养实验中，每列代表一个生物学重复。对于单培养实验，每列表示两次重复刺激独立实验的平均值。
三、流感病毒感染后不同时间段的小鼠肺组织ECM蛋白酶的表达谱
为探索蛋白酶在肺修复中的作用，作者收集了流感病毒感染后不同时间段的小鼠肺组织匀浆，鉴定了ECM相关基因的表达(图3)。ELISA检测支气管肺泡灌洗液中ECM蛋白酶和组织抑制金属蛋白酶(TIMPs)的表达量。ECM蛋白酶中，最早受诱导表达的是ADAMTS4——降解蛋白多糖versican的酶之一，其表达持续贯穿整个修复阶段(图3)。
根据scRNA-seq，ADAMTS4的表达仅限于非免疫的基质细胞(图4c)。接下来作者对感染前后的免疫和非免疫细胞亚群进行了分类。感染前，ADAMTS4基因仅在成纤维细胞和内皮细胞表达。感染后，仅在成纤维细胞中观察到ADAMTS4表达量显著上调，作者认为这解释了感染肺部中ADAMTS4的大量表达(图2d)。
Meta分析显示，在人类肺部疾病的一些数据集中，与健康对照组织相比，炎性肺疾病组织中ADAMTS4的表达显著增加。
四、流感病毒感染后小鼠肺组织的空间基因表达谱
作者在呼吸窘迫高峰期(感染后10天(dpi))收集小鼠肺切片进行空间转录组，无监督聚类识别出肺部区域(红色，簇0)与间质炎症区域重叠(图5)。与DRFibs相关的基因，包括ITGA5、LOX和ADAMTS4，在这些区域富集(图5)。ADAMTS4的表达局限于肺泡附近的间质炎症区。DRFib相关基因在支气管区域(绿色，簇2)、淋巴高浸润区(青色，簇3)和正常肺泡薄壁组织(黄色，簇1)低表达或不表达。总之，这些数据表明，当宿主感染病毒后开始恢复或病情恶化时，气管远端表达ADAMTS4的DRFibs发挥了重要作用。
五、ADAMTS4促进致命性免疫病理反应
为深入研究ADAMTS4对感染结果的影响，作者用致死剂量的甲型流感病毒对ADAMTS4野生型（WT）和ADAMTS4KO（KO）小鼠进行试验。相比WT小鼠，ADAMTS4KO老鼠生存率显著提高（图6a），肺部病毒感染区域面积无显著差异（图6b），动脉氧饱和度更高，肺功能更好（图6c & e）。在9 dpi时，ADAMTS4 KO小鼠的免疫细胞浸润和肺泡炎症显著减少，肺组织损伤程度较小(图3d)。
a，甲型流感病毒感染小鼠(WT, n=33, KO, n=23)的生存曲线。b，感染小鼠肺的代表性图像和病毒传播的定量。感染区域用红色标出; c，3和6 dpi时动脉血氧饱和度(SpO2)。d，接近致死剂量病毒感染9 dpi时代表性图像和组织学评分。e，接近致死剂量病毒感染气道阻力。
六、ADAMTS4是人类流感感染的预测因子
作者在3个队列中研究ADAMTS4对严重流感病毒感染的影响和作用。首先，基于儿童重症流感(PICFLU)网络中84名流感病毒感染儿童的多中心队列，采集儿童重症监护入院后72小时内收集的气管内吸气(ETA)样本，分析了ECM蛋白酶和TIMPs水平。作者发现ADAMTS4与IL-1B和TNF水平呈正相关，而IL-1B和TNF是ADAMTS4表达的上游调节因子。
作者分析儿童队列（PICFLU）发现ADAMTS4水平与相关疾病的严重程度显著相关。而2个成人队列（广州队列和台湾队列）中ECM蛋白酶、TIMP和细胞因子的调控模式与儿童队列相似(图7c)。并且，ADAMTS4主要位于下呼吸道中。
最后，作者分析后提出，下呼吸道中ADAMTS4蛋白水平是严重流感病毒感染后低氧呼吸衰竭和大范围死亡的强有力预测因子(OR = 2.22, P = 3.1 × 10−5)。
a, PICFLU队列分析物的相关矩阵。对于每个两两比较，颜色表示斯皮尔曼相关系数，而方框大小表示显著性水平。分析物按层次聚类进行排序。b，以性别、既往健康、年龄和类固醇治疗为协变量的VFD < 10的优势比。c，台湾和广州队列中每个患者从第一个可用时间点分析物的相关矩阵。d，以性别和年龄为潜在协变量的VFD < 10的比值比。b、d的优势比采用多重检验的logistic回归与FDR校正;阳性(红色)或阴性(蓝色)相关。
七、总结
本研究结合单细胞测序（scRNA-seq）和空间转录组（ST），研究了甲流病毒感染小鼠后CD45-细胞的单细胞和组织空间基因表达谱，发现呼吸道病毒感染诱导了成纤维细胞的三种不同激活状态，即细胞外基质(ECM)合成，损伤反应和干扰素反应状态。严重流感病毒感染时，肺成纤维细胞的过度活化可导致致命的免疫病理反应。通过产生ECM重构酶——特别是ECM蛋白酶ADAMTS4和炎症细胞因子，损伤反应成纤维细胞以损害肺功能为代价，改变了肺微环境以提高免疫细胞浸润。在三组呼吸道疾病队列中，下呼吸道ADAMTS4水平与季节性或禽流感病毒感染的严重程度相关。靶向损伤反应性肺成纤维细胞ECM蛋白酶活性的治疗药物，可能为重症呼吸道感染后保护肺功能和改善临床结果提供新方案。
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下期预告：小编解析心脏发育的空间转录组Cell文章。
参考文献
1. Boyd David F, Allen E Kaitlynn, Randolph Adrienne G et al. Exuberant fibroblast activity compromises lung function via ADAMTS4. Nature, 2020, 587: 466-471.
