文章仅是记录自己的学习使用，有错误请指出，我立刻改正！
官方说明：https://github.com/FelixKrueger/Bismark
一、Bismark Genome Preparation（建立索引）
cd /home/bismark_example/01index
bismark_genome_preparation \
--bowtie2 --path_to_aligner /home/Software/Bowtie2.V2.3.3/bowtie2-2.3.3/ \
--verbose \
/home/bismark_example/01index/
（一）重要参数
bismark_genome_preparation --help：查看帮助文档
- --bowtie2/--hisat2：调用bowtie2/hisat2建立基因组索引
- --path_to_aligner：比对软件所在文件夹的全路径
- --verbose：输出详情
- --parallel：设置线程，索引建立是并行运行，因此实际线程要×2
- --large-index：大基因组索引建立
- --yes：如果有安全类问题则自动选择yes，比如覆盖某个已存在的文件
- <path_to_genome_folder>：基因组所在文件夹路径，即/home/bismark_example/00index/
二、Bismark Compare（进行比对）
cd /home/bismark_example/02compare
bismark -N 0 -L 20 --quiet --un --ambiguous --sam \
--bowtie2 --path_to_bowtie2 /home/Software/Bowtie2.V2.3.3/bowtie2-2.3.3/ \
/home/bismark_example/01index/ \
-o /home/bismark_example/02compare \
--fastq \
--prefix test.file \
-1 /home/bismark_example/R1.fq.gz \
-2 /home/bismark_example/R2.fq.gz
（一）重要参数
bismark --help：查看帮助文档
- -N：设置seed中允许的最大错配数，可取0或1，默认为0。值越高，对齐速度越慢，灵敏度越高。
- -L：设置seed长度，最大值为32，默认为20。值越高，对齐速度越快，灵敏度越低。
- --quiet：不输出比对流程信息
- --un：过滤多处匹配的reads
- --ambiguous：多处匹配reads信息独立记录
- --sam/--bam：输出SAM格式，与--parallel不兼容/输出BAM格式，可调整--parallel
- --bowtie2/--hisat2 ：调用bowtie2/hisat2，默认bowtie2
- --path_to_bowtie2/--path_to_hisat2 ：bowtie2/hisat2所在文件夹的全路径
- -o/--output_dir ：输出文件的全路径
- --samtools_path：samtools所在文件夹的全路径
- --prefix：指定输出文件的前缀
- --q/--fastq：输入文件为FastQ
- -f/--fasta：输入文件为FastA
- --phred33-quals/--phred64-quals：指定FastQ文件的质量分数格式，默认为phred33
- -1/-2：双端测序文件
- genome_folder：包含未修改的参考基因组和bismark_genome_preparation创建的子文件夹(CT_conversion/和GA_conversion/）的文件夹的路径，即/home/bismark_example/01index/
（二）输出文件
- test.file.R1_bismark_bt2_pe.sam 所有对齐和甲基化的信息
- test.file.R1_bismark_bt2_PE_report.txt 对齐和甲基化的主要信息概括
三、Bismark Duplicate（过滤重复）
cd /home/bismark_example/03duplicate
deduplicate_bismark \
-sam -p \
/home/bismark_example/02compare/test.file.R1_bismark_bt2_pe.sam \
--output_dir /home/bismark_example/03duplicate/
（一）重要参数
deduplicate_bismark --hel：查看帮助文档
- --sam/--bam：删除 Bismark 对齐产生的SAM/BAM 文件中的重复数据，建议用于WGBS，但不建议应用于RRS (reduced representation shotgun)，如 RRBS、amplicon or target enrichment libraries。
- -p/--paired ：前一步双端数据产生的结果文件
- -s/--single：前一步单端数据产生的结果文件
- --samtools_path：samtools所在文件夹的全路径
- --output_dir：输出文件夹路径
- --multiple：指定输入文件都作为一个样本处理，连接在一起进行重复数据删除。
对SAM文件使用Unix“cat”，对BAM文件使用“samtools cat”。所有输入文件的格式必须相同。默认情况下，标头取自要连接的第一个文件。
（二）输出文件
- test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplicated.sam
- test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplication_report.txt
四、Bismark Methylation Extractor（甲基化信息提取）
cd /home/bismark_example/04extractor
bismark_methylation_extractor \
--comprehensive --no_overlap -p --parallel 30 --split_by_chromosome \
--bedGraph --counts \
--CX_context \
--cytosine_report --report \
--buffer_size 30G \
--genome_folder /home/bismark_example/01index/ \
/home/bismark_example/03duplicate/test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplicated.sam \
-o /home/bismark_example/03duplicate >log 2>&1 &
（一）重要参数
bismark_methylation_extractor --help：查看帮助文档
- --comprehensive ：合并所有四个可能的特定链，将甲基化信息转换为context-dependent的输出文件
- --no_overlap：避免因双端读取read_1和read_2理论上的重叠，导致甲基化重复计算。可能会删去相当大部分的数据，对于双端数据的处理，默认情况下此选项处于启用状态，可以使用--include_overlap禁用。
- -p/--paired-end：前一步双端数据产生的结果文件
- --bedGraph：指将产生一个BedGraph文件存储CpG的甲基化信息（不与--CX联用，仅产生CpG信息）
- --CX/--CX_context：与--bedGraph联用，产生一个包含三种类型甲基化信息的BedGraph文件;与--cytosine_report联用，产生一个包含三种类型甲基化信息的全基因组甲基化报告
- --cytosine_report：指将产生一个存储CpG的甲基化信息的报告（不与--CX联用，仅产生CpG信息），默认情况坐标系基于 1
- --buffer_size：甲基化信息进行排序时指定内存，默认为2G
- --zero_based：使用基于 0 的基因组坐标而不是基于 1 的坐标，默认值：OFF
- --split_by_chromosome：分染色体输出
- --parallel：指定线程
- --report ：产生一个甲基化的summary总结报告
- --counts:展示bedGraph中每个C上甲基化和非甲基化reads数量
- --genome_folder：包含未修改的参考基因组和bismark_genome_preparation创建的子文件夹(CT_conversion/和GA_conversion/）的文件夹的路径，即/home/bismark_example/01index/
- <filenames> :SAM 格式的 Bismark 结果文件
（二）输出文件
1、CHG/CHH/CpG_context_test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplicated.txt
col1 : 比对上的序列ID
col2 : 基因组正负链：+ -
col3 : 染色体编号
col4 : 染色体位置
col5 : 甲基化C的状态（XxHhZzUu）
X 代表CHG中甲基化的C
x 代笔CHG中非甲基化的C
H 代表CHH中甲基化的C
h 代表CHH中非甲基化的C
Z 代表CpG中甲基化的C
z 代表CpG中非甲基化的C
U 代表其他情况的甲基化C(CN或者CHN)
u 代表其他情况的非甲基化C (CN或者CHN)
CpG：甲基化C下游是个G碱基。
CHH：甲基化C下游的2个碱基都是H（A、C、T）。
CHG：甲基化的C下游的2个碱基是H和G
2、test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplicated.bedGraph.gz
col1 : 染色体编号
col2 : 胞嘧啶（c）位置信息
col3 : 胞嘧啶（c）位置信息
col4 : 甲基化率
3、test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplicated.bismark.cov.gz
col1 : 染色体编号
col2 : 起始位置
col3 : 终止位置
col4 : 甲基化率 （col5/col5+col6）
col5 : 甲基化数目
col6 : 非甲基化数目
4、test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplicated.CX_report.txt
col1 : 染色体编号
col2 : 位置
col3 : 正负链信息
col4 : 甲基化碱基数目
col5 : 非甲基化碱基数目
col6 : 类型
col7 : 具体背景
5、test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplicated.M-bias.txt/...R1.png/...R2.png
#reads中每个可能位置的甲基化比例
CpG context (R1)
col1 : read position
col2 : 甲基化count（count methylated）
col3 : 非甲基化count（count unmethylated）
col4 : 甲基化率（beta）
col5 : coverage
6、M-bias plot 通过Perl模块GD:：Graph产生，没有模块的只产生M-bias.txt文件，可用--ignore参数忽略
- fig1.test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplicated.M-bias_R1.png
- fig2.test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplicated.M-bias_R2.png
7、test.file.R1_bismark_bt2_pe.deduplicated_splitting_report.txt 甲基化总体报告
- fig3.report.png
五、Bismark2report /bismark2summary（可视化生成HTML 报告页面）
#将前面步骤中产生的所有report文件汇集在一个文件夹内
cd /home/bismark_example/05report
bismark2report \
--dir /home/bismark_example/05report/
############
#bismark2summary我还没用过，下次再补齐
bismark2summary \
testA_bismark_bt2.bam testB_bismark_bt2.bam
（一）Alignment Stats
- 总的序列数、没有比对上的序列数、唯一比对的序列数和比对到基因组多个位置的序列数
- fig4.png
（二）Cytosine Methylation
- 甲基化位点的汇总信息，包括CpG, CHG, CHH 下的甲基化和非甲基化C的数目和比例
- fig5.png
（三）Alignment to Individual Bisulfite Strands
- 比对到OT, CTOT, CTOB, OB 4种链的reads 数量
- fig6.png
（四）Deduplication
- fig7.png
（五）Cytosine Methylation after Extraction
- fig8.png
