Identification of Therapeutic Targets in Rhabdomyosarcoma through Integrated Genomic, Epigenomic, and Proteomic Analyses

通过整合的基因组，表观基因组和蛋白质组学分析确定横纹肌肉瘤的治疗靶标

期刊：Cancer Cell；影响因子：26.602

发表单位：圣裘德儿童研究医院等 

导 读

    横纹肌肉瘤（RMS）是一种在骨骼肌中发生的侵袭性小儿癌症，但目前仍缺乏有效的靶向药物。2018年8月发表在《Cancer Cell》的一项研究中，通过对RMS的两种模型（肺泡RMS和胚胎RMS）进行基因组、表观基因组和蛋白质组学的联合分析揭示了可能的治疗靶点。研究发现表明，RMS细胞在各种途径（包括RAS–MEK–ERK–CDK4/6途径，未折叠的蛋白反应途径和有丝分裂检查点途径）中均具有异常活性。在测试的各种药物中，化学疗法与激酶WEE1抑制剂（干扰有丝分裂检查点）的组合最有效地阻止了小鼠原位患者来源的异种移植物的生长。此外，表观基因组和基因组分析表明，沿着肌肉发育程序的肺泡RMS比胚胎RMS出现得更多，为具有这些不同类型RMS的患者揭示了可能有用的诊断标记和其他靶标。这些发现可能导致针对RMS患者的针对性更强、亚型特异性的疗法。

摘 要

    针对患者肿瘤中体细胞突变的个性化癌症治疗越来越多地纳入实践。由于肿瘤特异性表观遗传干扰而引起的基因表达变化所导致的其他治疗弱点正在逐渐被认识到，这些基因组和表观基因组的变化最终在肿瘤蛋白组和磷蛋白组中表现出来。本研究整合了转录组、外基因组、蛋白质组/磷蛋白组数据来阐明横纹肌肉瘤（RMS）的细胞起源和治疗弱点。研究发现肺泡RMS在发育过程中比胚胎RMS发生得更远，并确定了RAS/MEK/ERK/CDK4/6、G2/M以及未折叠蛋白反应途径的失调。全面的临床前测试表明，靶向G2/M途径中的WEE1激酶是体内高风险RMS的最有效方法。

前 言

    横纹肌肉瘤（RMS）是一种儿童时期的实体瘤，具有骨骼肌特征，主要分为胚胎性横纹肌肉瘤（ERMS）和腺泡型横纹肌肉瘤（ARMS）两种亚型。大约75％的局部疾病患者可通过常规的多模式疗法治愈，但复发或转移性疾病的患者总生存率分别为17％和30％。由于RMS患者的整体生存率在过去15年中没有显著提高，迫切需要开发RMS的新型治疗方法。为了增进对复发性RMS的理解并提供更多的临床前模型，本研究建立了原位患者源性小儿实体瘤异种移植物（O-PDX）的集合，并联合基因组、表观基因组、转录组、定量蛋白质组以及磷酸化蛋白质组数据以全面阐述RMS的细胞起源以及治疗靶点。

研究概要

1  横纹肌肉瘤的表观遗传学分析

    针对RMS患者以及原位人源肿瘤异种移植（O-PDX）的肿瘤组织WGBS和RNA-Seq结果显示，大多数患者肿瘤和匹配的O-PDX与基因表达和DNA甲基化相关，并且肿瘤类型之间的差异与患者肿瘤中浸润的非肿瘤细胞有关。在紧接启动子下游的区域中发现了许多与DNA甲基化和mRNA表达呈负相关的基因，而在整个基因座中发现了许多与DNA甲基化和mRNA表达呈正相关的基因，并包含部分甲基化的结构域。差异表达和甲基化基因的通路分析表明，负相关的基因主要是胚胎骨骼肌发育的介质，而正相关的基因则主要是神经系统发育的介质。

    进一步对O-PDX肿瘤、成肌细胞、肌管及骨骼肌进行ChIP-seq，联合基因表达及DNA甲基化全面描绘表观基因组图谱，并对数据执行染色质隐性马尔可夫建模（chromHMM）。在ERMS中上调的基因包含ERMS特异性超级增强子，表观遗传上调的基因参与细胞外基质的组织和胚胎的形态发生，特别是四肢和骨骼系统的形成；在ARMS中上调的基因包含ARMS特异性超级增强子，其中许多与肌发生有关，表观遗传上调了参与肌肉分化的基因，这表明它在肌肉发育的后期被阻止。

图2，相对于启动子/增强子活性的表观遗传学差异。（A）代表性18个chromHMM状态的热图；（B）描绘了ERMS和ARMS中18个chromHMM状态在基因组注释区域中所占的比例；（C）MYOG的ChIP-seq峰和chromHMM；（D-F）分别为在ERMS中选择性表达的GAS2（D），在ARMS中选择性表达的NOS1（E），以及在成肌细胞中选择性表达的AXL（F）；（G）相对于ARMS，ERMS中上调或下调的基因的维恩图。

2  横纹肌肉瘤蛋白质组和磷酸化蛋白质组的定量分析

    对12个O-PDX以及人成肌细胞和成肌管的蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行定量，鉴定了16523个蛋白质和62965个磷酸化事件。主成分分析显示不同样本类型呈现明显分离。通过对肌细胞与肌管和RMS之间差异表达的蛋白质和磷蛋白的功能分析，确定了对肌发生重要的几种途径，包括Wnt、HH、PI3K、p38/MAPK、BMP和腺苷酸环化酶。MYOG是与肌肉分化相关的转录因子，与ERMS相比，ARMS表达的MYOG mRNA和蛋白水平更高，这表明其表达是分级的。MYF5在成肌过程中由成肌细胞瞬时表达，相对于肌肉，所有ARMS均表达较低水平的MYF5，而一部分ERMS则显示较高水平的MYF5 mRNA和蛋白质。MYF5和MYOG蛋白表达在大多数RMS中呈负相关，并以相同的模式激活MYOG转录靶基因。

图3，分析横纹肌肉瘤蛋白质组和磷酸化蛋白质组。（A）RMS肿瘤、肌管和成肌细胞的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的工作流程；（F、G）成肌细胞、肌管ERMS和ARMS的蛋白质组（F）和磷酸蛋白质组（G）的主成分分析；（J）对MYOG和MYF5进行蛋白质组学分析得出的Log 10蛋白表达强度的散点图；（K）对每种O-PDX肿瘤的MYOG和MYF5样品的代表性免疫染色和MYOG和MYF5免疫阳性细胞百分数的散点图。

3  使用多个平台的集成分析

    作者随后通过肿瘤中差异表达的蛋白质和mRNA，并整合了保守的基因/蛋白质进行了共表达聚类，获得4个蛋白质簇（IPC）。IPC1包含相对于成肌细胞在肿瘤中上调的基因/蛋白质，IPC2包含ERMS中上调的基因/蛋白质，IPC3包含ARMS中上调的基因/蛋白质，IPC4包含的基因/蛋白质相对于成肌细胞在肿瘤中被下调。作者还对每个IPC进行蛋白网络的通路分析，并将转录组学、表观基因组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据与顺序统计数据进行了整合。MYOG是ARMS中排名最高的基因/蛋白质之一，而MYF5在ERMS中排名最高。相对于ERMS，ARMS中最上调的途径是肌生成。观察到ARMS和ERMS之间NOS1 mRNA /蛋白的差异表达，NOS1在ARMS中排名最高。还确定了ARMS和ERMS中相对于成肌细胞的G2/M和E2F目标上调。

图4，转录组、表观遗传学和蛋白质组/磷酸化蛋白质组数据的整合。（A）基于差异表达聚类和PPI网络模块的蛋白质组和转录组数据整合方案；（C）通路富集热图，用于分析每个IPC中的基因/蛋白质；（E）G2/M检查点模块的放大图，显示了代表性的基因/蛋白质。

4  靶向横纹肌肉瘤中的RAS-CDK4/6途径

    作者分析了患者种系组织、RMS和匹配的O-PDX的WGS和WES数据，在RMS中发现了18个在具有致病性癌症突变的基因。相对于成肌细胞，RAS、mTORC1和PI3K-AKTmTOR信号传导途径的RMS失调，并发现这些路径下游E2F靶标的失调。表观遗传学分析证实E2F转录靶标如CDK1在RMS中被激活，蛋白质组/磷酸化和免疫组化染色数据表明cyclin D/CDK4/6-RB/E2F途径在O-PDX中活跃。随后，作者测试了抑制RAS-CDK4/6途径是否有助于治疗RMS，发现MEK抑制剂与CDK4/6抑制剂的组合可协同降低癌细胞的存活率，然而体内靶向RAS-CDK4/6途径却无效。

图5，针对横纹肌肉瘤中的RAS和CDK4/6。（A）RAS和CDK4/6途径的简化途径图；编码蛋白质的基因经常发生突变，用紫色和粗体标出，用小分子抑制剂靶向；（D）代表性ERMS和ARMS肿瘤切片H&E染色或cyclin D2（ERMS）、cyclin D3（ARMS）和phosphoRB1（pRB1）免疫组化染色；（G、H）通过生物发光随时间变化测量O-PDX肿瘤负荷的代表性图（G），以及palbociclib+trametinib治疗组PD小鼠的图像（H）。

5  靶向横纹肌肉瘤中的G2/M和未折叠蛋白反应（UPR）途径

    因为在体内靶向RAS-CDK4/6途径无效，并且RMS中几乎没有可药用的突变，作者试图通过集成数据集鉴定与治疗相关的肿瘤易感性。分析发现，靶向UPR和G2/M检查点途径的HSP90抑制剂ganetespib（GSP）和WEE1抑制剂AZD1775显示出显著的体外活性。许多HSP90靶标是信号转导途径的关键调节因子。热休克转录因子HSF1的过度磷酸化是细胞应激的标志，发现HSF1的蛋白质水平和磷酸化增强以及RMS肿瘤中的HSF1靶基因表达，GSP处理细胞可以迅速诱导HSP70和其他HSF1靶基因的表达。使用对加性相互作用剂量模型的双变量响应分析每种药物组合的作用，发现GSP增强了化疗诱导的O-PDX细胞死亡。WEE1在细胞周期中调节G2/M检查点和DNA复制。相对于成肌细胞，RMS的表观遗传学、基因表达和蛋白质组/磷酸化数据揭示了该途径的上调。用AZD1775处理RMS细胞系会导致G2/M期停滞，这表明WEE1和HSP90均可能是RMS的可治疗目标。

图6，针对横纹肌肉瘤中的HSP90。（A）RMS中由HSP90调节的六个成肌途径；（E）HSF1靶基因（HSPA1A）的ChromHMM和通过RNA-seq（FPKM）的相应基因表达；（F）受试药物的有效浓度的热图；（G）GSP或IRN+VCR处理后，细胞中HSP70表达的免疫印迹。

6  体内靶向G2/M和UPR途径

    作者最后对靶向G2/M通路进行了体内试验评估。通过O-PDX荷瘤小鼠进行1、2、3期临床前药代动力学实验实验，使用GSP以及AZD1775与标准治疗药物联合给药，结合小鼠肿瘤大小变化及生存期进行评估，结果表明G2/M通路上WEE1激酶是治疗高风险RMS的最有效作用靶点。AZD1775+VCR+IRN治疗有70%（26/37）表现为完全响应（CR）或部分响应（PR ）， AZD1775+IRN为39%（14/36）CR+PR 。

图8，AZD1775和Ganetespib的临床前测试。（A）使用O-PDX的原代培养物对GSP和AZD1775的剂量反应曲线；（B）O-PDX肿瘤（蓝色）和血浆（红色）中GSP的PK图；（F）AZD1775组和GSP+IRN+VCR组的小鼠及其肿瘤的代表图像；（H）治疗组小鼠的生存曲线。

讨 论

    为了跨越基因组分析的局限并确定可能在RMS中失调的基本途径，本研究进行了综合转录组学、表观遗传学和蛋白质组学/磷酸化分析。研究确定了UPR和G2/M有丝分裂纺锤体检查点途径是RMS综合分析中变化最大的途径。观察到RMS细胞系和O-PDX对GSP的敏感性高于其他小儿实体瘤，对WEE1的抑制也是如此。GSP+VCR+IRN在临床前1期研究中耐受性良好，在2期研究中部分有效，该发现可能为高风险RMS患者的未来临床试验提供依据。根据广泛的3期临床前研究，研究强调将VCR与AZD1775和IRN结合使用，以提高RMS患者发生反应的可能性。