期刊：《PLOS ONE》
影响因子：3.24
文章题目：Integrative analyses of metabolome and transcriptome reveals metabolomic variations and candidate genes involved in sweet cherry(Prunus aviumL.) fruit quality during development and ripening
发表期刊：《PLOS ONE》
技术手段：RNA-Seq、LC-MS代谢组学
派森诺与鲁东大学携手合作，于近期在《PLOS ONE》上发表关于代谢组和转录组的联合分析，揭示了甜樱桃果实发育和成熟过程中涉及的代谢变化以及筛选到的相关候选基因。
研究背景
甜樱桃(Prunus avium L.)因其外观诱人、口感鲜美、营养价值丰富，是一种广受欢迎的商业果树作物。甜樱桃在发育成熟过程中糖、有机酸、色素、挥发性芳香物质等成分变化迅速，是果实品质研究的理想模型。糖和酸的积累形成了独特的口感，它们是评价果实生理和口感方面的重要因素。甜樱桃含有多种多酚化学物质，具有较高的抗氧化活性，对人体健康有益。因此，对甜樱桃发育和成熟过程的研究可以帮助我们了解果实质量和形状的变化，特别是与味道、颜色和健康相关的营养物质。
本研究旨在利用广泛靶向代谢组学方法对黑珍珠甜樱桃果实品质形成过程进行研究。此外，采用代谢组学和转录组学相结合的方法，研究甜樱桃发育和成熟过程中显著差异表达代谢产物(DEMs)和差异表达基因(DEGs)之间的相关性。为了进一步研究品质的形成，我们重点研究了与糖、有机酸和类黄酮代谢相关的DEMs和DEGs。本研究将为从代谢产物变化和分子机制方面理解果实品质形成提供了新的思路。
技术路线
研究结果
1、甜樱桃果实发育过程中的生理指标
为了研究甜樱桃果实发育过程中的品质和代谢变化，我们选择了4个发育阶段(10、25、33和40天)进行实验和代谢分析。不同时期采集的甜樱桃果实外观如图1A所示。在40天时，果实颜色逐渐由红色变为暗红色(图1A)。值得注意的是，果实硬度从10 天时的11.6 N迅速下降到33天时的1.2 N，在40 天时的暗红色成熟期达到0.7 N(图1B)。可溶物与果实硬度呈负相关，从10天的6.8%持续增加到40天的18.2%(图1C)。果实颜色指标a*/b*的比值从10 天时-0.46迅速增加到40天时的4.1，表明果实的颜色从绿色变为红色(图1D)。此外，甜樱桃果实发育过程中花青素含量也与颜色变化相一致，暗红色成熟期花青素含量达到23.3 mg/100 g (图1E)。
图1黑珍珠甜樱桃果实发育和生理变化
2、甜樱桃的代谢组学分析揭示了发育阶段的代谢物动态变化
为了更好的了解甜樱桃发育过程中的代谢物变化，在四个发育阶段应用了基于LC-MS/MS的广泛靶向代谢组学。如图2A所示，各代谢物在不同阶段表现出明显的差异，重复之间具有较高的可重复性。图2B显示4个发育阶段差异表达代谢产物(DEMs)的热图分析，结果表明许多代谢物在每个发育阶段都有高表达。根据不同发育阶段DEMs的变化情况，进行聚类分析，将DEMs按其变化趋势分为9类(图2C和2D)。簇8和簇9的代谢产物在不同发育阶段的表达量呈现出相似的增长趋势。有趣的是，甜樱桃果实的TSS、a*/b*比值和花青素含量也出现了这种趋势(图1C-1E)，而这与甜樱桃果实的营养和色泽形成密切相关。
图2甜樱桃发育至成熟的代谢组学动态研究
3、代谢物的多变量分析
火山图显示了10天 vs 25天、25天 vs 33天和33天 vs 40天的所有差异代谢物，分别是167个 (115个上调，52个下调)、115个 (84个上调，31个下调)和135个 (41个上调，94个下调)(图3A)。三个比较组之间的共同49差异代谢物 (图3B)，4个果实发育阶段的49种常见代谢物聚类热图如图3C。从图3C可以看出，大部分代谢物在青果期至红果期(33天)积累，在33天时达到峰值(图3C)。
图3甜樱桃果实不同发育阶段代谢产物积累的差异
此外，对DEMs进行KEGG通路分析，以确定显著富集的代谢通路。三个比较组中最显著富集的通路都涉及代谢途径和次生代谢物的生物合成(图4A-4C)。为了进一步研究甜樱桃发育过程中显著变化的代谢物，我们绘制了三个比较组中10个最显著富集代谢通路中显著差异的代谢物热图(图4D-4F)。除苯甲酸外，其他9种代谢物在10天的表达量显著高于25天(图4D)。对于33天 vs 40 天，前10个DEMs在40天的表达均显著高于33天(图4F)。我们还关注了10天vs 40天的DEMs，以观察整个生长期代谢物的变化，其中6种黄酮类化合物在40天均呈显著上调趋势(图4G)。
图4 差异代谢产物的KEGG富集分析
4、转录组变化以及转录组学和代谢组学联合分析
对不同发育阶段的甜樱桃样本进行RNA-seq分析， PCA中PC1显示10天、25天样本与33天、40天样本明显分离，而在PC2中， 33天和40天样本位于相邻的位置(图5A)。在三个比较组中，共鉴定出6724个DEGs。图5C的热图显示了6724个DEGs的表达水平，它们表现出不同的表达模式。
在每个比较组中，所有DEMs和DEGs的变化由九象限图(图5D)显示。象限3和象限7的DEMs和DEGs为正相关，象限1和象限9的DEMs和DEGs为负相关(图5D)。与10天 vs 25天相比，25天 vs 33天和33天 vs 40天的DEMs和DEGs数量明显减少，表明甜樱桃从青果期到褪青期变化强烈。为了研究显著变化的代谢物，我们使用相关网络图进一步研究前10个DEMs与主要DEGs (图5E-图5H)。相关分析表明，这些DEGs可能在甜樱桃整个发育时期的关键代谢中发挥直接或间接的调控作用。
图5 代谢组和转录组数据的相关性分析
5、糖、有机酸和类黄酮代谢相关的表达模式
为了进一步探讨甜樱桃发育和品质形成的转录调控机制，我们对甜樱桃发育和品质形成高度相关的DEGs与前10个显著差异代谢物在四个比较组的代谢途径进行可视化展示(图6)。根据前10个显著差异代谢物的分类属性，与之高度相关的DEGs富集在糖、有机酸、类黄酮代谢途径(图6)。
在糖代谢方面，主要代谢物G6P在10天 vs 25天中显著下调，但从33天到40天中显著积累(图6A)，40 天的G6P含量显著高于10 天的甜樱桃(图6A)。与G6P形成和代谢密切相关的酶包括己糖激酶(HK)、磷酸葡萄糖异构酶(PGI)和磷酸葡萄糖醛基酶(PGM)。PGI (A5)的转录水平在10天至25天显著增加，在以后的发育阶段维持在较高水平。蔗糖-磷酸合成酶(SPS, A10)的表达与PGI (A5)的表达完全相反，在33天时处于较低水平，然后从全红到暗红阶段急剧增加。
对于有机酸代谢，一些主要的代谢物在这一途径富集，包括柠檬酸、酮戊二酸、谷氨酸、延胡索酸、天冬氨酸和天冬酰胺(图6B)。从青果期(10天)到褪青期(25天)，柠檬酸、酮戊二酸、延胡索酸和天冬氨酸含量明显降低，从全红期(33 天)到暗红期(40天)，柠檬酸、酮戊二酸、延胡索酸和天冬氨酸含量增加。
在类黄酮代谢方面，槲皮素、儿茶素和花青素等主要代谢物在果实发育过程中显著增加，而它们的前体苯丙氨酸则相反(图6C)。花青素的变化趋势与花青素浓度的变化趋势一致(图1E)。在这项研究中,几乎所有参与类黄酮代谢途径的DEGs在33天或40天的表达量达到最高。与此相反，在果实发育过程中，4CL(C2)和花青素还原酶(ANR, C13)的水平降低。ANR的表达水平与花青素含量的趋势相反(图6C)。
图6 糖、有机酸和类黄酮代谢通路
文章小结
甜樱桃果实在发育和成熟过程中，代谢产物的组成和含量的不同导致了果实品质性状的显著变化。味道、颜色和营养是水果品质的重要组成部分。主要代谢产物在青果期、褪青期、全红期和暗红期之间存在显著差异，这可能是导致不同时期果实品质差异的主要原因。此外，结合代谢组和转录组分析表明，糖、有机酸、类黄酮代谢产物和相关基因之间存在显著相关性。这些相关的DEGs可能在果实的生长、发育和成熟过程中发挥重要作用。这些结果为甜樱桃代谢物以及果实品质性状的分子机制研究提供了更广阔的视角。
本研究中转录组和代谢组的测序与数据分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。
