一、实验目的

    掌握蛋白类药物SDS-PAGE法检测分子量和纯度的原理和方法。

二、实验原理

    SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS-PAGE)，也叫变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种含有蛋白变性剂SDS（十二烷基硫酸钠）的常用电泳技术，常用于检测蛋白质。

  聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合成的三维网状结构。SDS-PAGE一般采用不连续凝胶系统，即含有不同孔径的两层凝胶：上层胶（5%浓缩胶）和下层胶（分离胶），浓缩胶孔径较大，不同大小的蛋白质分子泳动速率相同，较稀的样本经过浓缩胶的迁移作用被浓缩至一个狭窄的区带，当进入小孔径的分离胶后，不同大小蛋白质由于所带电荷不同，表现出不同的迁移率，由于分子筛效应和电荷效应，使不同蛋白质在同一电场中能够有效的分离。

  蛋白样品电泳前，需与上样缓冲液（Loading Buffer）混合后煮沸处理，上样缓冲液中含有强还原剂（DTT或2-Me）和蛋白变性剂SDS，破坏了蛋白质的空间结构，将蛋白质解聚成多肽链，并将SDS包覆在肽链表面，SDS带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，使蛋白带有一致的负电荷（约2个氨基酸一个SDS）和一致的形状（棒状），消除了不同蛋白质之间的电荷差异和结构差异。由于SDS与蛋白质的结合是与分子量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度主要取决于分子大小。

  通过将未知分子量蛋白和多种已知分子量蛋白一起电泳，对比其迁移速度，推算出未知蛋白的分子量近似值。多种已知分子量蛋白称为蛋白分子量标准，也叫蛋白Marker，市面上有成品销售，本实验采用多色预染Marker，也称彩虹Marker。

三、仪器与试剂

1. 试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、电泳级SDS、丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺）、四甲基乙二胺（TEMED）、甲醇、过硫酸铵（AP）、考马斯亮蓝R250、冰乙酸、纯化水、6X Loading Buffer、10 kDa-180 kDa蛋白Maker；

    1×电泳缓冲液、10% SDS、30%丙烯酰胺、1M Tris-HCl（pH=6.8）、1.5M  Tris-HCl（pH=8.8）、脱色液、10% 过硫酸铵（AP）、考马斯亮蓝染色液、目的蛋白样本。 

2.材料：烧杯、不锈钢盆、EP管、防爆夹、浮漂、加样枪及枪尖、量筒、吸量管、10mL离心管。

3.仪器：FA2004N型电子天平、DYY-8C型电泳仪、DYY-BC型垂直电泳槽、制胶器、微波炉、电磁炉、纯水机。

四、实验步骤

1．配液：根据用量，按照《附录：SDS-PAGE法检测分子量试剂配方》进行配制。

2．制胶

    垂直电泳槽的玻璃板清洗干净后，将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃板放入电泳槽支架内（短玻璃朝里），并将电泳槽支架在桌面水平轻轻磕几下，使玻璃板底部对齐，然后插入斜插板到适中程度，并将其固定在制胶器上，按照配方配制10%的分离胶10mL（2块胶），和4mL 5%的浓缩胶（2块胶），分离胶加入TEMED后立即混匀，迅速沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓滴入，小心不要产生气泡，给浓缩胶留出约2 cm的空间。在丙烯酰胺溶液上缓慢覆盖纯化水进行压实，防止空气扩散到凝胶中抑制聚合作用，并保证凝胶表面水平。在室温条件下，凝胶应在30min左右聚合完成，聚合后凝胶和上层液相之间可见折射率的变化。

    倒掉覆盖层纯化水，并用滤纸条吸净残留的水，注意勿破坏凝胶表面，浓缩胶中加入TEMED，混匀后迅速加在分离胶上，并立即插入干净的加样梳，注意不要混入气泡。约30min浓缩胶聚合后，拆下制胶器，放入电泳槽内，在两片玻璃板中间加注1×电泳缓冲液后小心移去梳子，避免破坏加样孔，加样梳取出后，一定要观察凝胶梳齿是否歪斜，如有歪斜，需要用注射器针头或者接种针将其摆正。最后再加入少量电泳缓冲液，使玻璃板内缓冲液呈满溢状态，外周电泳液深度约2-3 cm左右即可。

3．制样

  将目的蛋白样品（约1mg/mL）于-20℃冰箱中取出，室温融化后混合均匀，取出25μL置于一新1.5mL EP管内，加入5μL  6X Loading Buffer，混合均匀，盖上管盖，并在管盖上标记好组别，用防爆夹夹住管口，插入到浮漂孔内，100℃煮沸5 - 15 min，本实验采用的蛋白Marker为预处理样本，不需要此煮样操作。

4．加样

  电泳槽内加电泳缓冲液没过加样孔，倾斜整个装置以赶走凝胶下面可能留有的气泡，按预定顺序加样，每孔加入20μL，在蛋白Marker孔中加入5μL蛋白Marker。

5．电泳

  加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，设置恒压80V（电压调80V，电流调最大）20min，样品中的溴酚蓝指示剂压缩成一条直线且到达分离胶后，调节恒压120V 约1h 40min（或200V 30-40min），当溴酚蓝指示剂迁移到凝胶前沿时关闭电源停止电泳。从电泳装置上卸下玻璃板，用卡片剥下凝胶后切除一角以标注凝胶方位（或将Marker孔设置在前面）。

6．染色

  将凝胶冲洗后浸泡在染色液中，置于摇床上37℃染色2h或者室温染色过夜（快速染色可用微波炉煮沸后静置10min，2-3次重复），染色液可回收重复利用。

7．脱色

  染色结束后，将凝胶漂洗后浸泡在脱色液中，置于摇床上脱色过夜，其间更换脱色液3次；或采用快速脱色，微波炉煮沸后静置15min，3-4次重复，每次均换新脱色液。直至蛋白条带清晰为止。

8．分子量

  将显示蛋白条带的凝胶拍照，采用凝胶呈像系统软件计算分子量和纯度，并粘贴实验结果照片。

五、注意事项

1．实验中大部分试剂具有毒性，操作时应戴上手套，注意防护；

2. 制胶前玻璃板位置不要歪斜，旋紧旋钮时需要两侧同时用力，防止漏胶；

3. 制胶时TEMED最后加入，加入后立即进行制胶，防止凝固太快导致制胶失败；

4. 制胶时待胶凝固后再进行下一步操作，凝固时间一般为30min，但室温低时可能会延长；

5. 加样梳取出后，一定要观察凝胶梳齿是否歪斜，如有歪斜，需要用注射器针头或者接种针将其摆正；

6. 制样时一定要用防爆夹夹牢EP管，防止煮沸过程中管盖爆开导致样品损失；

7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20存放数月，但是反复冻融会使蛋白质降解；

8.上样时，小心不要使样品溢出而污染相邻加样孔，蛋白Marker孔不要设置在中间，防止分不出凝胶正反面；

9.为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳；

10.电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动。

六、思考题

  制胶时加入TEMED作用是什么？为何最后加入？

附录：SDS-PAGE法检测分子量试剂配方

1.10% SDS：10g SDS，加纯化水定容至100mL。

2.30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1g，加纯化水定容至100mL。

3.1M Tris-HCl（pH=6.8）：将24.22g Tris用纯化水溶解，加浓盐酸调节pH=6.8，纯化水定容200mL。

4.1.5M Tris-HCl（pH=8.8）：90.85g Tris用纯化水溶解，加浓盐酸调pH=8.8，纯化水定容至500mL。

5.10% 过硫酸铵（AP）：2g过硫酸钠，加纯化水定容至20mL，1mL/支分装，-20℃冻存。

6.5×电泳缓冲液：15.1gTris碱，94g甘氨酸，5g电泳级SDS，加纯化水溶解后定容至1000mL，用前5倍稀释。

7.考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R250  0.5g，加入甲醇 150mL，冰乙酸 50mL，研磨溶解，滤纸过滤后，加纯化水定容至500mL。

脱色液：冰醋酸 100mL，甲醇 300mL，加纯化水定容至1000mL。

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