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Lecture 9: Eukaryotic Transcription Termination
Segment 1: Capping and Polyadenylation of Transcripts
RNA出来后5端被加帽酶加帽子以防止被降解。当加帽酶与CTD结合后加帽酶的工作效率可以提升十万倍。
Segment 2: Steps of mRNA Polyadenylation多聚腺苷酸化
多聚腺苷酸化因子识别RNA上的polyA信号序列，导致转录终止。
RNA剪切由两种因子介导一个是CPSF另一个是CstF，他们会识别AAUAA片段并剪切。
POLYA聚合酶在mRNA 末端3端加入AAAAAAAAAAAAAAA，以防止mRNA 被降解。形成poly尾巴之后polyA结合蛋白结合上去。一般polyA尾大概有200核苷酸的长度。
Segment 3: Release释放 of RNA Pol II
Rat1降解了聚合酶上残留的RNA。聚合酶由此从DNA上脱落。
Segment 4: Chromatin Structure染色质结构 and Regulation of Transcription转录调控
Segment 5: How RNA Pol II Transcribes Through ChromatinRNA聚合酶II如何贯穿染色质转录
FACT蛋白能够促进染色质转录。FACT从核小体上移除H2A/H2B二聚体或异源二聚体，留下组蛋白六聚体 (hexamer)。一般认为这会减弱核小体与DNA间的作用，这就使聚合酶相对容易穿过核小体。核小体可以看做一个臃肿的障碍。
SPT6加FACT能把H2A/H2B二聚体装回去
Segment 6: Rate-Limiting Steps of RNA Pol II Transcription
- 染色质结构的抑制作用阻止了DNA的开放性：如果基因被30纳米纤维包裹，大部分转录因子无法接近这部分DNA。
- 招募基本转录因子和RNA聚合酶
- 形成开放复合体，这就关系到TFIIH的活性。
- 启动子清除，关系到TFIIH的活性
- RNA聚合酶II在启动子邻近区域会停顿，需要招募PTEFb来越过这个起始停顿位点
Segment 7: The Gal4 Domain Swapping Experiment
普坦什尼实验室的斯坦·菲尔德斯 (Stan Fields)证明了蛋白质的一部分也可以发挥作用
Lecture 10: DNA Binding Regulators of Eukaryotic Transcription
Segment 1: Sequence-Specific DNA Binding Transcription Factors序列特异性DNA结合转录因子
为确定哪部分蛋白发挥作用，将蛋白依次砍掉，若砍掉后不再与DNA结合了，说明从N端开始的第四条的蛋白序列并没有发挥作用；从C端开始的第六条蛋白序列也没有发挥作用，所以发挥作用的是最下面的部分。
怎样确定与DNA结合的蛋白哪部分发挥作用？
Segment 2: SELEX: Identifying Target Sequences of DNA Binding Proteins
SELEX：用于确定识别序列未知的蛋白结合位点
- 怀疑结合位点位于紫色区域，因此随机分配了ATCG核苷酸在里面，再用DNA双链与之互补。
- 将DNA与蛋白孵育
- 寻找结合了DNA的蛋白，纯化（凝胶迁移或免疫沉淀都可以做）
- PCR扩增，重复步骤一
- 对结合到蛋白上的DNA进行测序
SELEX的步骤
-
读取测序后的结果如下。该图显示了出现该序列可能的概率。例如最右端两个肯定是C，右边数第三个可能是C也可能是A。
测序后的结果
Segment 3: Transcription Activating Domains in DNA Binding Proteins
我们找出了蛋白的DNA结合域，又要怎么找到蛋白的激活域呢？
将异源DNA结合位点Gal4DNA结合域融合到全长基因当中，并将下面的activator-binding site替换为Gal4-binding site
对蛋白进行删除，看看它对转录激活产生了什么影响，这里我们观察的是βGal的活性，如果发生激活，会产生多个+，图中黄色方框圈出的是蛋白的激活域
Segment 4: Targets of Transcription Activating Factors
- 很多DNA结合转录因子会与RNA聚合酶II相互作用
- 基本转录因子
- PTEFb：显然它能促进释放停顿的聚合酶
- 染色质修饰因子
Segment 5: Examples of Repressive Transcription Regulation
基本上真核细胞中的转录都通过激活机制来工作，但是也有阻遏的存在，以下是几个例子。
Segment 6: Gene Silencing
- 基因组里的一段沉默区域会关闭那里所有的转录单元。这里的基因关闭是非特异的，这些基因沉默区域抑制了沉默区域之内的所有基因。
- 在这类沉默基因之内的染色质叫作异染色质(heterochromatin)，对大多数基因 如果你把它放到异染色质区域，它们就会被关闭。
Segment 7: Gene Silencing Example 1
多梳家族可能的作用机制
Segment 8: Barriers to Gene Silencing
怎样让基因沉默停下来
- HATs
H3K79
Segment 9: Gene Silencing Example 2
一种经典的异染色质蛋白 叫HP1
