(1)动物处理：用颈椎脱臼法处死使新生乳鼠断髓迅速死亡，然后将整个乳鼠浸入盛有 75%酒精的烧杯中2~3秒(浸泡时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内，影响培养)后迅 速置于消毒的培养皿中，带入超净工作台内进行无菌操作取材。
(2)取材：将乳鼠俯卧位，用乙醇进行一次背部消毒，再用消毒的解剖剪剪开背部肋下缘 脊柱两侧的皮肤，剖开腹部，取出肝脏放入另一培养皿中，除去其他连带组织，用消过毒的吸管小心吸取PBS溶液漂洗肝组织3次，每次1~2ml, 洗去血污，将废液弃于废液杯中。
(3)组织分离：用眼科剪和镊子将肝门区所附的血管结缔组织尽可能去除，然后将肝组织 反复剪碎，直至剪成0.5~1mm³ 的小块后，加入PBS 1~2ml,另取1只吸管前端反复吹打清洗组织 块儿3次，弃废液。
(4)接种：用吸管加2滴小牛血清，小心地用弯头吸管前端将组织块轻轻吹打均匀制成悬 液，然后仍用吸管前端吸取组织悬液、将其均匀地(组织块之间相距约0.5cm左右)排种在培养 瓶底壁上；每个25ml的培养瓶中可接种20块左右。
(5)培养：将培养瓶慢慢翻转，使瓶底向上，加入1~2ml培养液，拧紧瓶盖，做好标记，置 37℃恒温箱中培养1~2小时，待组织块略干燥能牢固贴于瓶壁上后，再缓慢翻转培养瓶(尽量注 意不要使组织块漂浮起来),另加入培养液2ml左右使其能覆盖组织块，将瓶盖调整在略微松弛 状态，继续置37℃恒温箱静放培养。
(6)观察：细胞接种后一般几个小时内即可贴壁，并开始生长。培养24小时后，倒置显微 镜下可观察到少量的细胞从组织块周围游离出来；48小时后，可见大量的细胞放射状排列于组 织块的周围，这些细胞的胞核较大，胞质内容物较少，透明度高，彼此间排列紧密。靠近组织块 的细胞胞体较小，圆形，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大。如果无污染且 细胞生长良好，可见培养液颜色由原来的橘红色变成黄色。此时可补加或更换培养液。10~15 天后可长成致密单层细胞。这时可进行传代培养。
