对应原版教程第14章http://bioconductor.org/books/release/OSCA/overview.html”
单细胞的多组对照设计（例如正常组与给药组）可以为细胞类型水平比较提供以往Bulk RNA-seq分析所不能达到的精度。对此一般有两种进阶分析思路：
（1）DE(Differential expression)--两组样本的同一细胞类型的基因表达差异分析；（2）DA(Differential abundance)--两组样本的同一细胞类型的丰度差异分析

源网侵删

笔记要点

1、示例数据解读
2、DE分析
3、DA分析
4、最后关于DE&DA的思考

1、示例数据解读

• 小鼠胚胎的单细胞测序数据，根据是否注射 td-Tomato-positive ESCs 分为两组，每组各3次重复；其中涉及3个批次，每个批次包含两组中的一个(如下图所示)。

  
  

#已完成质控、聚类、批次矫正、细胞类型注释
merged

table(merged$tomato,merged$pool)      
#           3    4    5
#  FALSE 1047 3097 6829
#  TRUE  2411 3007 4544

library(scater)
#同一聚类图谱中两组样本的细胞数目分布
head(table(colLabels(merged), merged$tomato))
#    FALSE TRUE
# 1   431  322
# 2   541  404
# 3   335  250
# 4  1257  979
# 5   610  456
# 6   504  433

#观察细胞类型注释情况
by.label <- table(colLabels(merged), merged$celltype.mapped)
pheatmap::pheatmap(log2(by.label+1), color=viridis::viridis(101))

2、DE分析

2.1 流程

• （1）pseudo-bulk sample
  对于两组样本的同一细胞类型的基因表达差异分析，由于每组里的每个样本均有上百个细胞。这里我们将每一个样本某一细胞类型的所有细胞，按照基因累加counts表达值，当作该样本的该细胞类型的Bulk RNA-seq表达矩阵(pseudo-bulk)。

summed <- aggregateAcrossCells(merged, 
                               id=colData(merged)[,c("celltype.mapped", "sample")])
summed
#15179   192 即6个样本的32种细胞类型的15179个基因表达情况
#以 Mesenchyme 基因为例
label <- "Mesenchyme"  #间质细胞
current <- summed[,label==summed$celltype.mapped]
head(counts(current))
#         [,1] [,2] [,3] [,4] [,5] [,6]
# Xkr4       2    0    0    0    3    0
# Rp1        0    0    1    0    0    0
# Sox17      7    0    3    0   14    9
# Mrpl15  1420  271 1009  379 1578  749
# Gm37988    1    0    0    0    0    0
# Rgs20      3    0    1    1    0    0

colData(current)[,c("sample","tomato","pool","celltype.mapped")]
# DataFrame with 6 rows and 4 columns
# sample    tomato      pool celltype.mapped
# <integer> <logical> <integer>     <character>
# 1         5      TRUE         3      Mesenchyme
# 2         6     FALSE         3      Mesenchyme
# 3         7      TRUE         4      Mesenchyme
# 4         8     FALSE         4      Mesenchyme
# 5         9      TRUE         5      Mesenchyme
# 6        10     FALSE         5      Mesenchyme

# follow edgeR的差异分析流程，构建DGElist对象
library(edgeR)
y <- DGEList(counts(current), samples=colData(current))
y

3 advantages of "pseudo-bulk"
(1) Larger counts are more amenable to standard DE analysis pipelines designed for bulk RNA-seq data.
(2) Collapsing cells into samples reflects the fact that our biological replication occurs at the sample level.
(3) Variance between cells within each sample is masked, provided it does not affect variance across (replicate) samples.
接下面的流程均以6个样本的Mesenchyme间质细胞 Bulk RNA-seq表达矩阵为例进行分析。

• （2） QC质控过滤
  首先需要过滤表达量小的样本。这里就是指细胞类型组成数目少的样本，例如可以定义少于10个细胞组成的样本均为低质量样本。

discarded <- current$ncells < 10
y <- y[,!discarded]
summary(discarded)   #如下没有样本被过滤掉
#   Mode   FALSE 
# logical       6

然后进一步过滤低表达的基因，其在大部分样本里均低于最低阈值的表达水平。

keep <- filterByExpr(y, group=current$tomato)
y <- y[keep,]
summary(keep)
#   Mode   FALSE    TRUE 
#logical      83    5815

• （3）标准化
  对pseudo-count矩阵进行标准化处理，主要目的是为了校正因细胞组成数目不同造成的不同样本的基因表达差异。即使得不同样本的同一基因的表达水平具有可比性。

y <- calcNormFactors(y)
y

• （4）差异分析（校正批次效应）
  首先需要交代design matrix

# tomato 为分组情况
# pool 为批次情况
y$samples[,c("tomato","pool")]
#        tomato pool
#Sample1   TRUE    3
#Sample2  FALSE    3
#Sample3   TRUE    4
#Sample4  FALSE    4
#Sample5   TRUE    5
#Sample6  FALSE    5

design <- model.matrix(~factor(pool) + factor(tomato), y$samples)
y <- estimateDisp(y, design)
fit <- glmQLFit(y, design, robust=TRUE)
res <- glmQLFTest(fit, coef=ncol(design))
topTags(res)

DEGs are defined as those with non-zero log-fold changes at a false discovery rate of 5%.

• 以上是对于某一细胞类型，分组样本的差异分析流程；
• scran包提供了自动计算所有细胞类型的差异分析的函数pseudoBulkDGE()，结果保存为list对象。

# Removing all pseudo-bulk samples with 'insufficient' cells.
summed.filt <- summed[,summed$ncells >= 10]

library(scran)
de.results <- pseudoBulkDGE(summed.filt, 
    label=summed.filt$celltype.mapped,
    design=~factor(pool) + tomato,
    coef="tomatoTRUE",
    condition=summed.filt$tomato 
)

#查看某一种细胞类型的差异分析结果
cur.results <- de.results[["Allantois"]]
cur.results[order(cur.results$PValue),]

#因为没有对比样本而未能差异分析的失败的细胞类型(之前的过滤步骤)
metadata(de.results)$failed
#[1] "Blood progenitors 1" "Caudal epiblast"     "Caudal neurectoderm" "ExE ectoderm"       
#[5] "Parietal endoderm"   "Stripped" 

2.2 结果解读

• （1）所有细胞类型的差异基因概况

is.de <- decideTestsPerLabel(de.results, threshold=0.05)
summarizeTestsPerLabel(is.de)

• （2）celltype-common DEG，即在大部分细胞类型均差异表达的基因

up.de <- is.de > 0 & !is.na(is.de)
head(sort(rowMeans(up.de), decreasing=TRUE), 10)

如下图，举例来说Mid1基因在91%的细胞类型中均上调差异表达

#同理计算下调的common deg
down.de <- is.de < 0 & !is.na(is.de)
head(sort(rowMeans(up.de), decreasing=TRUE), 10)

• （3）celltype-specific DEG，即仅在某一特定细胞类型差异表达的基因
  一种思路是根据之前计算的差异分析结果，找出该细胞类型的差异基因里，在其它细胞类型中不是差异基因的celltype-specific gene；

# Finding all genes that are not remotely DE in all other labels.
remotely.de <- decideTestsPerLabel(de.results, threshold=0.5)
not.de <- remotely.de==0 | is.na(remotely.de)
not.de.other <- rowMeans(not.de[,colnames(not.de)!="Allantois"])==1

# Intersecting with genes that are DE inthe allantois.
unique.degs <- is.de[,"Allantois"]!=0 & not.de.other
unique.degs <- names(which(unique.degs))

# Inspecting the results.
de.allantois <- de.results$Allantois
de.allantois <- de.allantois[unique.degs,]
de.allantois <- de.allantois[order(de.allantois$PValue),]
de.allantois

另一种思路就是改变差异分析的零假设，直接寻找celltype-specific的基因

de.specific <- pseudoBulkSpecific(summed.filt,
    label=summed.filt$celltype.mapped,
    design=~factor(pool) + tomato,
    coef="tomatoTRUE",
    condition=summed.filt$tomato
)

cur.specific <- de.specific[["Allantois"]]
cur.specific <- cur.specific[order(cur.specific$PValue),]
cur.specific

• 可以实际绘制基因表达的箱图，观察是否为细胞类型特异的差异基因。

# sizeFactors(summed.filt) <- NULL
plotExpression(logNormCounts(summed.filt),
    features="Rbp4",
    x="tomato", colour_by="tomato",
    other_fields="celltype.mapped") +
    facet_wrap(~celltype.mapped)

2.3 矫正测序胞外RNA干扰

• (1) 胞外RNA的影响的示例数据
  在细胞裂解液制备的过程中，对于某一种细胞来说，有可能引入自身并不表达的extracellular RNA，并计入count矩阵，从而影响了差异分析结果（不同测序条件的ambient RNA影响肯定是不同的）。
  例如数据集Tal1ChimeraData，按照是否敲除Tal1基因分为WT与KO两组。在已经完成细胞类型注释的基础上，对neural crest神经嵴细胞进行差异分析。但是根据差异分析结果，发现包含大量的hemoglobin血红蛋白基因(下调)。这是有问题的，因为该细胞不会表达相关基因，即可能在其中一组(WT)中存在明显的ambient RNA干扰。

library(MouseGastrulationData)
sce.tal1 <- Tal1ChimeraData()
library(scuttle)
rownames(sce.tal1) <- uniquifyFeatureNames(
  rowData(sce.tal1)$ENSEMBL, 
  rowData(sce.tal1)$SYMBOL
)
summed.tal1 <- aggregateAcrossCells(sce.tal1, 
                                    ids=DataFrame(sample=sce.tal1$sample,
                                                  label=sce.tal1$celltype.mapped)
)
summed.tal1$block <- summed.tal1$sample %% 2 == 0 # Add blocking factor.
# Subset to our neural crest cells.
summed.neural <- summed.tal1[,summed.tal1$label=="Neural crest"]
# Standard edgeR analysis, as described above.
res.neural <- pseudoBulkDGE(summed.neural, 
                            label=summed.neural$label,
                            design=~factor(block) + tomato,
                            coef="tomatoTRUE",
                            condition=summed.neural$tomato)
summarizeTestsPerLabel(decideTestsPerLabel(res.neural))
# Summary of the direction of log-fold changes.
tab.neural <- res.neural[[1]]
tab.neural <- tab.neural[order(tab.neural$PValue),]
head(tab.neural, 10)

• (2) 矫正胞外RNA的影响的思路
  第一种思路：在获得可以分析的counts矩阵之前，都会过滤含有大量为捕获到细胞的empty droplet。我们可以重新利用这些empty droplet基因表达情况，估计样本受到的ambient RNA。

library(DropletUtils)
#定义一个空列表，用于储存每个样本的sample  ambient RNA
ambient <- vector("list", ncol(summed.neural))

# Looping over all raw (unfiltered) count matrices and
# computing the ambient profile based on its low-count barcodes.
# Turning off rounding, as we know this is count data.
for (s in seq_along(ambient)) {
    #获取每一个样本还没有过滤空液滴的最原始表达矩阵
    raw.tal1 <- Tal1ChimeraData(type="raw", samples=s)[[1]]
    #预估每一个样本的ambient情况
    ambient[[s]] <- estimateAmbience(counts(raw.tal1), 
        good.turing=FALSE, round=FALSE)
}

# Cleaning up the output for pretty printing.
#合并所有样本的ambient effect
ambient <- do.call(cbind, ambient)
colnames(ambient) <- seq_len(ncol(ambient))
rownames(ambient) <- uniquifyFeatureNames(
    rowData(raw.tal1)$ENSEMBL, 
    rowData(raw.tal1)$SYMBOL
)
head(ambient)
##          1  2  3  4
## Xkr4     1  0  0  0
## Gm1992   0  0  0  0
## Gm37381  1  0  1  0
## Rp1      0  1  0  1
## Sox17   76 76 31 53
## Gm37323  0  0  0  0

#然后据此预测过滤后的表达矩阵的可能受污染的基因表达比例
max.ambient <- maximumAmbience(counts(summed.neural), 
    ambient, mode="proportion")
head(max.ambient)
##           [,1]   [,2]  [,3] [,4]
## Xkr4       NaN    NaN   NaN  NaN
## Gm1992     NaN    NaN   NaN  NaN
## Gm37381    NaN    NaN   NaN  NaN
## Rp1        NaN    NaN   NaN  NaN
## Sox17   0.1775 0.1833 0.468    1
## Gm37323    NaN    NaN   NaN  NaN

#最后将样本平均污染比例超过10%的基因认为是不合格基因，将其从DEG列表中过滤掉
contamination <- rowMeans(max.ambient, na.rm=TRUE)
non.ambient <- contamination <= 0.1
okay.genes <- names(non.ambient)[which(non.ambient)]
tab.neural2 <- tab.neural[rownames(tab.neural) %in% okay.genes,]
table(Direction=tab.neural2$logFC > 0, Significant=tab.neural2$FDR <= 0.05)
head(tab.neural2, 10)
#根据结果可以看到原本sig DEG的血红蛋白基因已经被过滤掉了。

#血红蛋白基因一定是不表达的
is.hbb <- grep("^Hb[ab]-", rownames(summed.neural))
alt.prop <- controlAmbience(counts(summed.neural), ambient,
    features=is.hbb,  mode="proportion")
alt.non.ambient <- rowMeans(alt.prop, na.rm=TRUE) <= 0.1
okay.genes <- names(alt.non.ambient)[which(alt.non.ambient)]
tab.neural4 <- tab.neural[rownames(tab.neural) %in% okay.genes,]
head(tab.neural4)

第二种思路：上述的方法的前提是提供有未过滤空液滴的原始表达矩阵，但对于挖掘公共来源的单细胞表达矩阵一般都是过滤后的，不能够提供可以参考的ambient profile。所以再推测ambient profile是很难的。一种想法是，即假设ambient RNA对所有细胞类型的影响都是相同的，所以specific-common DEG是很值得被怀疑的，但也存在很多问题。具体可参看原教程，这里不多阐述了。

3、DA分析

3.1 思路

细胞类型丰度的差异分析是指对于同一种细胞类型的数目在不同分组中是否有显著的差异。基本流程类似上面的DE pipeline，只是表达矩阵(列为样本细胞类型，行名为基因，值为基因表达水平)变成了细胞丰度矩阵(列为样本，行为细胞类型，值为细胞组成数目)，同样采用 edgeR pipeline。

3.2 流程

#计算细胞类型数目总和
abundances <- table(merged$celltype.mapped, merged$sample) 
abundances <- unclass(abundances) 
head(abundances)
##                      
##                        5  6   7   8   9  10
##   Allantois           97 15 139 127 318 259
##   Blood progenitors 1  6  3  16   6   8  17
##   Blood progenitors 2 31  8  28  21  43 114
##   Cardiomyocytes      85 21  79  31 174 211
##   Caudal Mesoderm     10 10   9   3  10  29
##   Caudal epiblast      2  2   0   0  22  45

#构建DEGlist对象
extra.info <- colData(merged)[match(colnames(abundances), merged$sample),]
y.ab <- DGEList(abundances, samples=extra.info)
#y.ab$samples$sizeFactor

#过滤低丰度的细胞类型
keep <- filterByExpr(y.ab, group=y.ab$samples$tomato)
y.ab <- y.ab[keep,]

#差异分析
design <- model.matrix(~factor(pool) + factor(tomato), y.ab$samples)
y.ab <- estimateDisp(y.ab, design, trend="none")
fit.ab <- glmQLFit(y.ab, design, robust=TRUE, abundance.trend=FALSE)
res <- glmQLFTest(fit.ab, coef=ncol(design))
summary(decideTests(res))
##        factor(tomato)TRUE
## Down                    1
## NotSig                 22
## Up                      1
topTags(res)

上述流程中，未执行DE里的calcNormFactoors()这一步骤；仅根据DEGlist计算library size进行统一文库大小。这可能会引起composition effect，即一种细胞类型的“高表达”在同一文库大小情况下，势必会引起其它细胞类型丰度的非正常减小。当然可以使用calcNormFactoors()进行矫正，但这需要假设大部分细胞类型的丰度没有显著差异，这对于DA分析是比较困难的。可以通过设定较高的DEG阈值、不考虑明显高丰度的细胞类型进行一定程度的消减。

4 最后关于DE&DA的思考

• 对于多分组设计的单细胞测序实验，往往会涉及多个批次。关于批次矫正，在上一节笔记中强调了批次整合最好仅用于common cluster、annotation、visualization。对于差异分析，还是建议使用原始的count矩阵，并设置batch effect参数。
• 对于DE与DA这两种分析策略，由于基因表达的差异是细胞聚类、注释的基础。所以这两种思路本质是对同一种生物学现象的阐述，主要区别在于聚类、注释的分辨率的高低，在实际分析过程中均可以尝试分析。