Nat Biotech | 深部组织多光子成像非侵入式研究大脑结构和功能

原创 huacishu 图灵基因 2022-06-26 10:50 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学技术

撰文：huacishu

IF=54.98

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亮点：

1、作者在多项 AO 显微成像技术的基础上，开发了一种新型活体自适应光学三光子显微成像（AO-3PM）系统，该系统结合全新自适应光学技术和三光子显微成像，实现了穿过活体小鼠完整头骨在大脑深层的高分辨率成像；

2、该系统大幅提升了非侵入式活体成像的图像质量，为无损的研究大脑结构和功能提供了强有力的工具和方法。

香港科技大学Jianan Y. Qu（瞿佳男）教授课题组在国际知名期刊Nat Biotechnol在线发表题为“Deep tissue multi-photon imaging using adaptive optics with direct focus sensing and shaping”的论文。由于生物物质的复杂结构引起的光学像差和光散射，组织深处的高分辨率光学成像成为了一个具有挑战性的问题。本研究作者提出了一种自适应光学三光子显微镜（ALPHA-FSS），ALPHA-FSS可准确测量并有效补偿标本引起的像差和散射，并恢复亚细胞分辨率。具有远程聚焦的共轭自适应光学配置能够通过完整颅骨下方750µm的深度对小鼠皮质中的精细神经元结构进行活体成像，从而实现皮质中的近无创高分辨率显微镜检查。作者还展示了通过完整颅骨进行高灵敏度和高精度激光介导显微手术的功能性钙成像。此外，还实现了完整脑内深皮质和皮质下海马体的活体高分辨率成像。

作者提出的共轭α-FSS–3PM系统由三个关键模块组成，即直接聚焦传感、共轭自适应光学（AO）和远程聚焦模块，如图1a所示。为了评估α-FSS–3PM的效果并表征其在穿透颅骨成像中的性能，作者首先进行了一项体外实验，通过在切除的完整颅骨下方将荧光珠嵌入琼脂糖中进行成像。为了测量波前畸变，强光束停在最亮的区域例如荧光珠的中心，而弱光束用于扫描16×16 µm2的视野（FOV），以捕获复杂的电场点扩散函数（PSF）。然后，通过使用测量的E场PSF的二维傅里叶变换，即可快速准确地确定并有效地校正总体像差。可以看出，仅通过系统像差校正记录的荧光珠图像高度失真，旁瓣的出现表明由厚颅骨引起的高阶像差（图1b）。

相反，通过将校正相位模式应用于空间光调制器（SLM）以补偿样品引起的像差（图1c），有效地恢复了高成像分辨率，并将荧光强度提高了200倍以上（图1b，d）。但是，衍射限制分辨率没有完全恢复，可能是由于剩余的未校正散射引起的。在AO显微镜系统中，波前校正器通常投影到物镜的后瞳孔平面。这种称为瞳孔AO的配置几乎在所有AO显微镜中都有实现。然而，瞳孔AO校正只能在非常小的FOV（<30µm直径）上恢复聚焦质量，如图1e所示。为了在单AO校正的情况下获得更大的有效成像体积，作者将共轭AO与远程聚焦相结合。使用快速电可调谐透镜（ETL）进行扫描，远程聚焦引起的像差被计算为系统像差的一部分，并在α-FSS AO校正之前由DM进行校正。作者测量了在琼脂糖中直径为0.2 µm的无像差荧光珠样品中，作为焦点调谐距离函数的远程聚焦的分辨率。在所有体外和体内研究中，以实验测量的分辨率作为基准来评估共轭α-FSS–3PM的性能。对于深度>400 µm的成像，激发光束大于SLM，导致分辨率降低。如图1f、g所示，共轭AO单次校正后的有效FOV在横向和纵向上分别扩展至150 µm和400 µm，与瞳孔AO配置相比，校正体积增加了100倍以上。此外，由于扫描是通过远程聚焦实现的，无需物镜和波前校正器的物理平移，因此可以轻松实现不同成像平面的快速扫描。

接下来，作者验证了结合α-FSS–3PM通过完整颅骨改善活体脑成像的能力。在成年Cx3Cr1 GFP小鼠的结合AO构型中获得了绿色荧光蛋白（GFP）标记的小胶质细胞的活体图像。使用传统的3P显微镜（系统AO校正）几乎无法识别完整颅骨下方300 µm处小胶质细胞的详细结构。通过使用GFP信号的直接聚焦传感，AO有效地补偿了样本诱导的像差，并恢复了小胶质细胞的过程，但其有效FOV被限制在30 µm以下。相比之下，共轭AO不仅在分辨率和信号强度方面提供了与瞳孔AO类似的改进，能够清晰地分辨小胶质细胞过程，但也能将校正后的FOV大幅放大至120 µm。此外，结合远程聚焦的AO能够在100 µm至500 µm的成像深度上有效提高成像分辨率（图1e–g）。

研究发现，尽管脑深部区域（例如490 µm处）的像差可能需要覆盖更大颅骨区域的校正相位模式，但在300 µm处测得的校正波前仍显示出较好的信号强度。简而言之，在当前深度测量的附加校正相位被添加到先前深度测量的相位，以生成完整AO校正的最终和最佳相位模式。这样，可以有效地测量深度上的像差，进一步提高信号强度和空间分辨率。这些结果揭示了结合α-FSS AO的巨大优势，该AO具有远程聚焦功能，可在大体积上通过完整颅骨对小鼠皮质进行活体高分辨率成像。

接下来，通过完整的颅骨对小鼠大脑皮层的神经元和血管结构进行了活体成像。图2a显示了一只成年Thy1 YFP转基因小鼠的皮质，其头骨厚度为100 µm。在这里，用单波长（1300 nm）3P激发，实现了YFP标记的锥体神经元和脑微血管的双色荧光成像。可以看出，即使校正了系统像差，通过完整颅骨的3P成像中的对比度和分辨率也会随着深度的增加而迅速降低（图2a），这主要是因为颅骨诱发的像差引起的激发PSF失真。因此，荧光发射水平非常低的神经元树突，在200 µm深度以上的完整颅骨中，常规3P成像几乎无法观察到。使用高灵敏度的α-FSS方法，激发光所经历的像差和散射都可以准确确定并有效校正。通过这种方式，最佳PSF的AO恢复导致分辨率大大提高，信号显著增强（高达40倍），使得精细结构，如神经元树突，可以通过完整的颅骨清晰可见（图2b-i）。但是，活体成像中的信号改善程度小于完整颅骨下方相同深度处荧光珠的信号改善程度。这可能是由于运动效应，如心跳和呼吸，将不可避免地导致体内PSF测量的误差；皮质组织的散射也在一定程度上降低了信号的增加。有趣的是，图2d、h中的校正相位图案在中心区域中更平滑。这可能是因为入射角较低的中心光线进入样品时，光与组织的相互作用长度较短，因此，与边缘光线相比，其像差和散射较小。AO校正后，微血管结构的全颅骨成像也得到了显著改善，深度处的信号背景比（SBR）大大增加。

借助快速直接聚焦传感，作者还将α-FSS–3PM应用于神经元活动的功能性钙成像。为了使直接聚焦传感有效工作，在荧光波动的聚焦传感过程中，将锁定检测信号的输出归一化为荧光信号。这样，可以消除由快速变化的钙荧光引起的测量的E场PSF中的伪影，从而能够准确地确定像差。接下来，通过完整的颅骨对CCK-GCaMP6s转基因小鼠皮层中的GCaMP6s标记神经元进行活体钙成像。如图3所示，仅使用AO系统，树突的钙信号变得无法检测，因为背景噪音过大。通过α-FSS AO校正，来自神经元胞体和树突的荧光信号显著增加，分辨率显著提高，从而能够记录同步的躯体-树突活动（图3d，e）。此外，由于共轭AO通过远程聚焦方法提供了大的成像体积和快速的扫描，展示了通过完整颅骨的不同皮质层的神经元和树突活动的近同步多平面钙成像。

小胶质细胞在脑内稳态和神经退行性疾病中发挥着重要作用。具有高分辨率的非侵入性成像工具对于研究小胶质细胞生理学至关重要。利用α-FSS-AO方法，通过对Cx3Cr1-GFP转基因小鼠大脑皮层小胶质细胞的头骨成像进行了体内研究。如图4a–c所示，共轭AO持续提高了图像分辨率和荧光信号，使我们能够在大成像体积上解析小胶质细胞的精细过程，否则，如果没有完全AO校正，就无法识别。此外，α-FSS使我们能够通过完整的颅骨进行精确的激光显微手术，这是研究各种病理条件下的细胞机制的有力技术。多个深度的延时成像显示，高度局限性病变仅激活少数相邻的小胶质细胞（在50µm的距离内），这些小胶质细胞以协调的方式迅速向病变延伸（图4a）。这些结果表明，除了通过完整颅骨对大脑进行高分辨率成像外，α-FSS在精确光学操作方面具有巨大潜力。最后，作者评估了结合α-FSS AO分别对头骨较厚（130–140 µm）的老龄（>10个月）小鼠和头骨机械变薄（约50 µm）的小鼠进行活体皮质成像的能力进行了考察。结果表明，AO辅助颅骨成像方法可以促进老龄小鼠大脑的活体研究，并且通过薄的颅骨比通过完整的颅骨获得更好的性能。此外，还通过对阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中小胶质细胞的头骨成像进行了体内研究，在该模型中，淀粉样斑块通过衰老在大脑中积聚，被认为是AD病理的机制。淀粉样斑块周围的小胶质细胞的形态可以通过140 µm厚的完整颅骨清楚地分辨出来，如果没有完全AO校正，这些是无法识别的（图4d）。观察到的斑块相关小胶质细胞的形态与之前的研究一致。

为了进一步推进成像深度，通过一个打开的颅骨窗口进行了3P成像，其中一部分颅骨被一块透明玻璃所取代，以提供直接的光学访问大脑。在体内对整个大脑皮层的锥体神经元进行成像，如图5a所示。在这里，α-FSS导致3P信号显著增加（约9倍），并恢复最深皮质层的突触分辨率，从而使基底树突的单个棘清晰可见（图5b-d）。由于厚而分散的大脑皮层所施加的限制，在不使用高侵入性程序的情况下，实现皮质以外和皮质下区域（例如海马）的活体高分辨率成像仍然是一项具有挑战性的任务。先前关于海马体内3P成像的研究提供了细胞水平的成像分辨率。如图5e所示，尽管在常规3P成像中可以识别海马CA1中的神经元胞体，但树突结构仍然无法清晰识别（图5e，i）。然而，使用α-FSS AO，显著改善了3P荧光信号，并成功恢复了突触分辨率，使海马CA1神经元的顶端树突清晰分辨（图5e-l）。

在这项研究中，作者开发了一种AO 3PM技术，该技术结合了两项创新：具有相位敏感检测的直接聚焦传感和具有远程聚焦的共轭AO。相位敏感检测技术对于准确测定散射和像差焦场至关重要，因此可以有效校正样品引起的像差和散射。作者进行了一系列实验，详细比较了α-FSS中使用的锁相检测相位调制法和之前研究中使用的相位步进法在电场测量中的效果。作者发现，采用锁相检测方法的相位调制的信噪比（SNR）通常高于相位步进法，这表明相敏检测方法在抑制噪声方面具有优越的性能，能够准确快速地校正样品引起的畸变。当相位步进在多个周期中执行时，α-FSS中的锁定相位检测和F-SHARP中的相位步进在信号分析方面基本上是等效的。与F-SHARP不同，α-FSS可以将相敏检测的频率推至MHz范围，这是由于1/F激光噪声的优势。结合远程聚焦的共轭AO确保了单个校正相位模式可以在单个大成像体积上恢复高成像分辨率。使用α-FSS–3PM系统，通过完整的颅骨进行了活体脑成像，这是一种理想的近乎无创但也极具挑战性的方法。通过校正标本引起的畸变，通过完整的颅骨实现了小鼠皮质的活体高分辨率成像。由于直接聚焦感应的速度很快，在深度显示了密集标记神经元的活体功能性钙成像，大大提高了灵敏度和准确性。作者还通过完整的颅骨和小胶质细胞反应的高分辨率动态成像展示了精确的激光显微手术。我们的研究结果表明，α-FSS技术在推进活体成像技术和促进活体脑神经科学研究方面具有巨大潜力。应该注意的是，尽管红细胞运动产生的伪影会略微影响精度，直接聚焦传感也可以通过来自血管的荧光信号来实现。虽然已经证明了α-FSS-3PM在1300 nm激发下进行脑深部成像的能力，但它可以毫无困难地应用于1700 nm激发。理论上，对于更大的成像深度，1700 nm处的3P激发是有利的，因为其有效衰减长度更长。然而，由于最大激发功率不应超过100 mW以避免组织损伤，由于3P激发效率低，成像深度受到大脑深层微弱信号的限制。据报道，量子点的3P激发截面比传统荧光染料的3P激发截面大4–5个数量级，并且能够在高达2.1毫米的深度下对小鼠脑血管进行3P成像。由于来自血管的3P荧光信号也可用于α-FSS，因此它可以作为脑深部区域畸变完全校正的起点，从而显著增强用荧光标记的细胞结构的荧光强度。

教授介绍

瞿佳男博士于1983年和1986年分别获得华中科技大学光学工程学士和硕士学位。1990年获中国科学院上海光学精密机械研究所光学博士学位。此后，他在加州大学欧文分校物理系工作了一年，并在不列颠哥伦比亚癌症研究中心担任博士后研究员两年多。瞿博士现为香港科技大学电子及计算机工程系教授。瞿博士是美国光学学会（OSA）和国际光学与光子学学会（SPIE）的当选会员。他是《光学快报》和《生物医学光学杂志》的专题编辑和编辑委员会成员。他的研究目标是为医学和生命科学中的问题提供工程解决方案。这一研究方向涵盖了应用于医学成像、生物医学光学和生物光子学、神经工程、医学电子学、生物信息学/计算生物学、生物信号处理、生物医学微器件和生物医学材料的工程原理和材料技术。

参考文献

Qin Z, She Z, Chen C, et al. Deep tissue multi-photon imaging using adaptive optics with direct focus sensing and shaping. Nat Biotechnol. 2022;10.1038/s41587-022-01343-w. doi:10.1038/s41587-022-01343-w