Save Time with Transient Plant Leaf Transformations

与植物一起工作并不总是一个耗时的过程。虽然在组织培养中培育转基因毛状根需要半年时间，而培育转基因植物可能需要更长的时间，但一个短暂的植物叶片转化过程可以为植物生物学家节省一些时间(…)。实际上是几个月。

在李帕森实验室，我们正在研究癌症治疗药物长春新碱和长春新碱的生产是如何在药用植物中得到控制的。长春花(图1)我们研究的最终目标是提高它们在植物或植物组织培养中的产量。

玫瑰C.不是一个典型的有机体，例如拟南芥或者烟草。研究基因功能玫瑰C.由于方法的可用性而受到很大的限制。感染发根农杆菌可用于组织培养中发育稳定的毛状根系。这种方法常用于玫瑰C.但在毛状根中不能研究光合活性组织的过程，因为根中缺少功能叶绿体和叶特异性细胞类型。转基因毛状根的发育至少需要6个月的时间。生产转基因植物所需的时间更长，劳动强度更大，效率更低，而且往往无法复制。在建立转基因培养或植物之前，我们的瞬时表达方法使我们能够快速筛选和研究转录因子候选物和生物合成途径中的基因调控。

为什么植物科学家会做短暂的叶片转化

转基因植物的发展是非模式生物普遍存在的问题。因此，瞬态方法通常是研究基因功能的首选方法，因为这些实验可以在几天到几周内完成，而不是几个月到几年。在植物科学中，“瞬时转化”通常指的是一个稳定的细胞系或植物不能从转化的组织中再生。基因功能通常通过瞬时沉默和/或在植物中过度表达感兴趣的基因来研究。

基因沉默的常用方法

病毒诱导基因沉默(VIGS)是一种利用病毒和植物转录后机制来沉默感兴趣基因的短暂技术(Unver和Budak，2009年)。这种方法适用于玫瑰C..

一种常见的过表达基因的方法

在像这样的植物中拟南芥和烟草，农杆菌渗透到叶片中是一种简单而有效的表达基因和评价其功能的方法。本质上农杆菌包含一个带有T-DNA(转移-DNA)区域的质粒。在感染过程中，这个T-DNA区域被转移到植物中.在实验室里，我们可以利用这一自然过程，用我们感兴趣的基因或报告基因替换T-DNA区域上的基因，从而跟踪转化和基因表达。在短暂的叶片转化过程中，农杆菌该菌株与叶片组织接触，并将带有感兴趣基因的T-DNA区域转移到细胞中。但为了C. 玫瑰, 农杆菌渗透到叶子里不起作用。,因为叶子有蜡质，很难渗透。

我们最近克服了这个问题玫瑰C.通过与幼苗一起工作并优化过渡转化过程的其他几个方面(Mortensen等人，2019年)。我们的方法也可以为其他物种的瞬时转化系统的开发提供一些有用的指导。

开发瞬态叶转换方法时应考虑的问题农杆菌:

如果您是这个领域的新手，以下是您第一次短暂的叶转换的有用提示：

检查您的种族是否有可用的工作协议。

这会帮你节省很多时间。别再发明轮子了。

测定不同叶龄

通常较年轻的叶子工作得更好。并不是每一片叶子都同样容易发生短暂的转化。

选择好的报告基因

有很多伟大的报告基因可用的和您选择的取决于您的实验(de Ruijter等人，2003年)。例如，我们对GUS基因进行了初步的转换，以确定转化是否成功。一旦我们走上正轨，我们就转向荧光素酶，更容易量化不同治疗方法对转化成功的影响。下面是一些报告基因的例子。

GUS基因(β-葡萄糖醛酸酶)用组织化学GUS染色是一个非常有用的视觉报告(图2)。GUS酶切割一个底物，然后形成蓝色沉淀。GUS通常是建立一个新的转换协议的首选，因为它可以很容易地显示哪些组织已经被转化。但是要注意：检查你组织中的GUS样活动。使用农杆菌缺乏GUS基因，因为植物可以内源性Gus样活性(Hu等人，1990年)。我们通常使用PSB 161-PL2_pSB 90_2x35S：：GUS：：TMA以确认转化成功。

荧光素酶是一种很好的定量报告，并利用底物产生生物发光。荧光素酶通常比GUS具有更短的mRNA和蛋白半衰期，因此是测定启动子活性的好时机记者。有用的积极控制可包括：PSB 96-PL2_pSB 90_2x35S：：Fluc-I：：TNO & PSB 166-PL2_pSB 90_TMAs：：rLUC-I：：PMA.

荧光蛋白(FP，例如GFP)可以以多种方式使用。通常，FP与感兴趣的蛋白质融合，以阐明你感兴趣的蛋白质的亚细胞定位。

从Lee-Parsons实验室找到所有的质粒。

不同入渗方法试验

共育(Li等人，2009年)：农杆菌与你的叶子是一个非常容易的转化方法，但可能是低效的许多物种。更有效的是注射器或真空渗透。

注射器渗透(d‘Aoust等人，2009年)：通常用没有针头的注射器注射农杆菌通过气孔培养进入叶的背面(下表面)。这是一种简单容易实现的技术。成功可能因实验者而异。

真空渗透(Mortensen等人，2019年)：叶子或整株植物被放置在农杆菌溶液和真空用真空钟或干燥器。成功的浸润通常可以通过组织的下沉来观察(见图3)。这种方法可能是最可伸缩的方法。

把你的植物移到黑暗里在改造前16小时.

我们通常在转化前16小时将我们的植物转移到黑暗中，在转化后的黑暗中再给它们留下两天的时间。

使用内含子

植物促进剂可以被识别或泄漏在农杆菌。这对于报告基因来说尤其有问题，因为您可能会从农杆菌，但不是植物。例如，我们看到了古斯具有CaMV35S启动子的基因农杆菌。通过使用内含子可以很容易地避免这种情况，这些内含子将从植物的转录本中删除，但不能从植物中删除。农杆菌.

试验不同农杆菌菌株

我们用被解除的武器根癌农杆菌GV 3101菌株(PMP 90)，对我们很有效。

使用工作良好的矢量系统

这使得您可以快速地组装向量并测试不同的想法。我们是超级粉丝基于金门的MoClo系统. 上面的博客文章中提到的向量已经准备好使用向量，但是使用MoClo系统，您可以轻松、快速地创建自定义向量。有关植物的MoClo的更多信息，请查看以下内容采访尼古拉赞助人，分享MoClo植物试剂盒.

对我们来说，瞬时叶片转化对筛选候选基因和加快研究是很有帮助的。当然，暂时的叶转换还有更多，但是我们希望这些技巧可以帮助您开始工作。一旦你在你的实验室建立了一个良好的协议，它就可以成为你的研究的有力工具。欢迎在下面的评论中添加更多的技巧和经验。

References

D'Aoust, Marc-André, et al. "Transient expression of antibodies in plants using syringe agroinfiltration."Recombinant proteins from plants. Humana Press, 2009. 41-50. PubMed PMID: 19183892.

De Ruijter, N. C. A., et al. "Evaluation and comparison of the GUS, LUC and GFP reporter system for gene expression studies in plants." Plant Biology5.02 (2003): 103-115.

Hu, Ching-yeh, et al. "Intrinsic GUS-like activities in seed plants." Plant cell reports 9.1 (1990): 1-5. PubMed PMID: 24226366.

Lee, Min Woo, and Yinong Yang. "Transient expression assay by agroinfiltration of leaves." Arabidopsis Protocols. Humana Press, 2006. 225-229. PubMed PMID: 16739580.

Li, Jian-Feng, et al. "The FAST technique: a simplified Agrobacterium-based transformation method for transient gene expression analysis in seedlings of Arabidopsis and other plant species." Plant methods 5.1 (2009): 6. PubMed PMID: 19457242. PubMed Central PMCID: PMC2693113.

Mortensen, Samuel, et al. "EASI transformation: An efficient transient expression method for analyzing gene function in Catharanthus roseus seedlings." Frontiers in plant science 10 (2019). PubMed PMID: 31263474. PubMed Central PMCID: PMC6585625.

Unver, Turgay, and Hikmet Budak. "Virus-induced gene silencing, a post transcriptional gene silencing method."International journal of plant genomics 2009 (2009). PubMed PMID: 19547658. PubMed Central PMCID: PMC2699436