[图片上传失败...(image-8370dc-1728378050264)]

Basic Information

• 英文标题： Tumour mutational burden: clinical utility, challenges and emerging improvements
• 中文标题：肿瘤突变负荷：临床实用性、挑战和新兴改进
• 发表日期：27 August 2024
• 文章类型：Review Article
• 所属期刊：Nature Reviews Clinical Oncology
• 文章作者：Jan Budczies | Albrecht Stenzinger
• 文章链接：https://www.nature.com/articles/s41571-024-00932-9

Abstract

1. 肿瘤突变负担（TMB），定义为癌症基因组中存在的全部体细胞非同义突变的总数，在不同的癌症类型间和类型内都有所不同。
2. 第一波回顾性和前瞻性研究将TMB确定为免疫检查点抑制剂反应的预测生物标志物，并在基于Keynote-158试验数据的情况下，以疾病不可知的方式批准了派姆单抗用于TMB高的肿瘤患者。
3. 尽管该试验的结果适用于所有癌症类型以及TMB的最佳阈值尚待确定，但TMB研究正在沿着三个主要途径推进：
4. 通过实验室过程中的严格质量控制措施提高TMB评估，包括减轻诸如有限的panel范围和低肿瘤纯度等混杂因素；
5. 通过融入如克隆性、持续性或HLA校正的TMB、肿瘤新抗原负荷和突变特征等创新概念，精细化传统的TMB框架；
6. 以及将TMB与已建立的和新兴的生物标志物（如PD-L1表达、微卫星不稳定性、免疫基因表达谱和肿瘤免疫背景）相结合。
7. 鉴于其在癌症发病机制以及免疫系统识别肿瘤的能力中的关键作用，深刻理解TMB的基本原理及其持续发展对于肿瘤学领域具有极其重要的意义。

Key points

• 肿瘤突变负荷（TMB）是预测不同癌症类型中免疫检查点抑制获益的生物标志物，在某些癌症类型中也有应用。
• TMB与10个突变/Mb的临界值一起，被纳入FDA对帕博利珠单抗（pembrolizumab）的实体瘤不依赖性批准，用于在标准治疗失败且缺乏替代治疗方案的晚期实体瘤患者。
• 使用大型测序面板和足够纯度的肿瘤组织样本是确保TMB精确量化和准确患者分层的关键。
• TMB对免疫检查点抑制剂响应的预测价值仅在某些组织类型中得到验证，即使在这些类型中，预测获益的敏感性和特异性也有限。
• TMB是包括抗原呈递、T细胞启动和抗原识别等一系列免疫过程中的第一步，所有这些过程都对抗肿瘤免疫反应至关重要。
• 为了提高TMB预测价值的研究努力包括通过选择或加权所包含的突变进行优化，或与其他基因和/或免疫相关肿瘤变量的评估相结合。

Introduction

para

1. 在超过五个十年的分子癌症研究和DNA测序过程中，已经在癌细胞内发现了各种基因改变，并且这些改变被确认为恶性转化的驱动力。
2. 肿瘤突变负荷（TMB）提供了一个度量标准，用于量化癌症基因组与其生殖细胞对应基因组的偏差，这一偏差由体细胞突变的集合来概括。
3. TMB概念在2013年首次大规模癌症测序工作完成后得到了重视，同时观察到不同类型癌症之间和内部TMB存在显著差异。

para

1. 在这篇综述中，我们首先讨论了TMB作为免疫检查点抑制剂（ICIs）益处的生物标志物的临床实用性。
2. 然后我们描述了可以应用的TMB的不同定义，并总结了潜在的突变过程。
3. 接下来，我们讨论了影响TMB测量和分析有效性的各种因素。
4. 在考虑了TMB的临床局限性之后，我们探讨了可能改善这一生物标志物性能的新兴策略。
5. 这些改进可以从概念上分为精炼（预先选择或加权包含的突变）和组合（通过将TMB与其他分子标志物结合，开发出单一、更准确的生物标志物）。

A biomarker for immuno-oncology

para

1. TMB作为免疫肿瘤学中一个有预测价值的生物标志物的原理证明，是通过分析2014年和2015年分别接受抗CTLA4抗体治疗晚期黑色素瘤患者队列以及接受抗PD-1抗体治疗的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者队列的开创性研究来实现的。
2. 在此基础上，TMB的临床应用受到了两个主要因素的推动，这两个因素在2018年左右都获得了相当的临床相关性。
3. 首先，基于Keynote-189（参考文献7）、Keynote-407（参考文献8）、Keynote-042（参考文献9）和CheckMate-227（参考文献10）的结果，ICIs作为晚期NSCLC患者的一线治疗手段的引入，以及涉及晚期黑色素瘤和肾细胞癌以及其他癌症类型的临床试验中同样充满希望的数据，产生了对更强大和互补的预测生物标志物的需求，以优化患者分层并改进治疗资源的分配，而不仅仅是基于肿瘤细胞PD-L1表达。
4. 其次，技术的进步和成本的降低使得在常规临床实践中使用包括300-500个基因的下一代测序（NGS）板成为可能，这使得从扩大的肿瘤分子剖析中获得了额外的临床效用。
5. 基于板载的TMB因此成为利用技术进步解决临床需求的优雅方法，并很快被认为是一种有前景的方法，可以筛选出最有可能从ICIs中受益的患者。

para

1. 癌症免疫疗法利用癌细胞表面上的肿瘤特异性抗原，这些抗原能被免疫系统识别（图1）。
2. 该通路的第一步是，突变基因的蛋白质产物被癌细胞处理并作为新抗原呈现，但也可以被专业的抗原呈递细胞（APC）捕获。
3. 随后，APC能够迁移到淋巴结并将抗原呈递给T细胞前体，这一过程受CTLA4调控。
4. 最后，呈现相同抗原的癌细胞可以被激活的细胞毒性T细胞识别，这一过程受PD-1及其配体PD-L1调控。
5. 由于TMB反映了可能用于处理的抗原数量，较高的TMB增加了至少一个高度免疫原性新抗原呈现的概率。
6. 在多个接受ICIs治疗的患者队列中，研究了高TMB患者免疫疗法效果更高的假设。
7. 同时，抗原处理、呈递和识别的复杂性，在某些患者中可能会出现缺陷，这表明除了TMB之外，还有多个其他因素可能影响免疫疗法的效果。

Fig. 1: Simplified representation of the effect of TMB on the tumour-specific immune response.

[图片上传失败...(image-f5def2-1728378050264)]

• 肿瘤突变负荷（TMB），定义为肿瘤基因组中存在的突变数量，是促进突变积累的各种过程在不同时间跨度上的后果。这些过程的不同的突变率决定了TMB高表型的概率。
• 校对缺陷（PRD）和错配修复缺陷（MMRd）机制的缺陷很可能会导致高或超高TMB，而与APOBEC激活或自发脱氨反应相关的突变过程则不太可能导致这种情况。
• 抗原摄取由树突状细胞完成。肿瘤来源的突变蛋白被专业的抗原呈递细胞（APCs）如树突状细胞内化，并经历细胞内加工，产生抗原肽。
• 为了向细胞毒性（CD8+）T细胞呈递新肽，这些新肽是T细胞介导的抗肿瘤免疫的关键，新肽被装载到MHC I类分子上；而那些打算呈递给辅助性（CD4+）T细胞的则被装载到MHC II类分子上。
• CD8+ T细胞启动。树突状细胞迁移到淋巴结后，在MHC I分子上向原始CD8+ T细胞（以灰色表示）呈递加工后的肿瘤来源新肽。
• 通过T细胞受体（TCR）识别这些抗原-MHC I复合物是T细胞激活的先决条件。CD28与CD80/CD86的相互作用提供的协同刺激信号也是这种激活所必需的。
• 激活后的T细胞经历克隆性扩增，并分化为具有特定功能的效果T细胞，包括细胞毒性T细胞。这一过程受到CTLA4的负向调控，CTLA4与CD80/CD86结合，以拮抗CD28的方式促进免疫耐受。
• 激活的CD8+ T细胞识别肿瘤细胞表面由MHC I呈递的肿瘤相关新肽。这种相互作用触发细胞毒性分子如穿孔素和颗粒酶的释放。
• 癌细胞也可能表达PD-L1，与CD8+ T细胞上的PD-1相互作用，导致T细胞活性受到抑制。CTLA4与CD80/CD86结合以及PD-L1与PD-1结合激活的下游信号通路使肿瘤能够逃避免疫监视。
• 高TMB的癌细胞可能产生更多的新肽（部分a），因此更有可能成功进行抗原摄取、加工和呈递（部分b和c），以及成熟（CD8+）T细胞识别的概率增加（部分d）。

para

1. TMB的高预期表现是由早期试验中测试ICIs的一些样本的回顾性分析中充满希望的数据所推动的。
2. III期CheckMate-026试验测试了尼伏单抗与铂类药物化疗作为IV期PD-L1阳性NSCLC（28-8检测≥1%）患者的一线治疗。
3. 在一项探索性分析中，TMB通过全外显子测序（WES）进行评估，TMB高定义为基线肿瘤样本中存在的体细胞错义突变最高三分之一（≥243）。
4. 比较尼伏单抗组中TMB高肿瘤患者与TMB中或TMB低肿瘤患者的结局，结果显示客观反应率（ORR；47%对23%）更高，中位无进展生存期（PFS；9.7个月对3.6-4.2个月）更长。
5. 此外，在TMB高亚组中，那些PD-L1高（≥50%）肿瘤患者的ORR更为有利（75%），而在TMB低亚组中，PD-L1表达没有预测价值。
6. 同样，对CheckMate-012试验中尼伏单抗加伊匹单抗臂的数据进行的事后分析显示，TMB高肿瘤患者的中位PFS为17.1个月，而TMB低肿瘤患者为3.7个月。
7. TMB高且PD-L1阳性（≥1%）肿瘤患者再次拥有最高的ORR（62.5%），TMB低亚组无论PD-L1表达如何，受益有限。
8. 这些结果表明，TMB具有与PD-L1表达相辅相成的预测价值，且从ICIs中获得临床受益的可能性，TMB高肿瘤患者比TMB低肿瘤患者要高得多。
9. 这一观点进一步得到了CheckMate-227部分1的PFS数据的证实，在该分析中，高TMB定义为每兆碱基≥10个体突变（编码碱基替换和短插入/缺失），根据FoundationOne CDx检测。
10. 满足这一标准的晚期NSCLC患者从尼伏单抗加伊匹单抗治疗中获得了显著更大的益处，与化疗相比（7.2个月对5.5个月；HR 0.58，97.5%CI 0.41-0.81；P < 0.001），不受PD-L1表达的影响。
11. 该试验的总生存期（OS）数据显示，与化疗相比，PD-L1阳性肿瘤（≥1%；17.1个月对14.9个月；P = 0.007）的患者从ICI方案中受益，这导致该组合在这一设置中得到监管批准。
12. 在同时根据TMB和PD-L1进行分层分析的OS亚组分析中，对于TMB高、PD-L1低（<1%）肿瘤的患者，尼伏单抗加伊匹单抗报告的受益水平最高。
13. 这些有些令人困惑的结果，以及可能批准尼伏单抗加伊匹单抗与PD-L1而不是TMB作为伴随生物标志物，至少部分可以由CheckMate-227部分1的混淆研究设计来解释：TMB高人群（≥10 mut/Mb）的PFS和PD-L1表达人群（≥1%）的OS被选为共同主要终点。

para

1. 随后，基于大量的回顾性和前瞻性数据，高TMB与ICIs获益之间的关系在多种癌症类型中得到了验证。
2. 在一项对超过3000名非小细胞肺癌（NSCLC）患者的回顾性分析中，高TMB（定义为和谐的TMB z-score ≥0）与ICIs的反应持续时间≥24个月相关，而高PD-L1水平则不是，与短期（<12个月）反应相比，表明TMB是长期获益更稳健的预测因子，并且可能是这种不常见但深远的临床结果的潜在替代指标。
3. 如果将TMB得分的前10%作为截止值，可以获得长期反应者的更大程度的富集。
4. 值得注意的是，在这些研究中，PD-L1表达与TMB没有正相关性，这表明这两种生物标志物在NSCLC患者和其他癌症患者中在很大程度上是独立的。
5. 两种生物标志物的独立性通过TCGA中21种癌症类型的PD-L1 mRNA水平与TMB之间缺乏任何显著相关性得到了验证，尽管微卫星不稳定（MSI-H）和POLE突变肿瘤是一个例外，它们同时具有高PD-L1 mRNA水平和高TMB。
6. 这些结果支持TMB作为ICIs获益的预测性生物标志物的作用，这一作用独立于PD-L1，并且是其补充。

para

1. TMB的潜力对于未知原发灶的癌症（CUP）尤其具有相关性，这类癌症占所有癌症的约3-5%。这些恶性肿瘤的特点是原发癌细胞起源未知，通常预后很差，1年生存率约为20%，中位总生存期约为3个月。
2. 几项分析CUP突变谱的研究数据显示，约10-20%的患者具有高TMB（根据板测序，采用介于12 mut/Mb和17 mut/Mb的截断值）。
3. 与其他肿瘤类型一致，对于经过大板NGS检测，具有高（≥12 mut/Mb）TMB的复发性和/或难治性CUP患者，nivolumab联合ipilimumab治疗可使客观缓解率（ORR）达到60%，1年无进展生存率（PFS）为60%，而在TMB低的患者中，这两个指标分别为7.7%和9%。
4. 此外，来自随机CUPISCO试验的数据表明，按照当前指南定义的新诊断的不利亚型CUP患者，若TMB≥16 mut/Mb，接受atezolizumab治疗相比于标准化疗，无进展生存期（PFS）显著更长。
5. 相比之下，atezolizumab联合铂类药物化疗仅略微提高了TMB<16 mut/Mb的未经治疗的CUP患者的 median PFS。
6. 最后，一项对24种癌症类型的超过8000名患者的TMB回顾性分析数据显示，23.9%和13.3%的CUP患者TMB分别≥10 mut/Mb和≥20 mut/Mb，且TMB≥10 mut/Mb与使用抗PD-1或抗PD-L1抗体的有利总生存期（OS）存在显著相关性（HR 0.52, 95% CI 0.30–0.90），不受微卫星稳定性状态影响。
7. TMB高与TMB低的CUP患者之间，从免疫检查点抑制剂（ICIs）获益的程度更高，以及CUPISCO试验的数据显示，在TMB高的CUP患者中，atezolizumab相比于标准化疗具有优势，这些结果支持将TMB作为该领域的生物标志物进行临床应用。

para

1. 基于血液的TMB（bTMB）为基于组织的TMB提供了一种较少侵入性的替代方法，可能在获得足够质量的肿瘤组织样本用于分子检测具有挑战性的环境中具有实用性，包括许多肺癌、CUP、复发性疾病和转移瘤患者。
2. MYSTIC试验的数据表明，从血浆样本中量化TMB是可行的，且bTMB截断值≥20 mut/Mb可以预测转移性NSCLC患者从度伐鲁单抗加特雷利单抗相比于化疗的临床获益。
3. 尽管频繁的检测失败（25–30%），例如由于样本中循环肿瘤DNA（ctDNA）不足，但81%的患者获得了有效的bTMB评分，而基于组织的TMB为63%。
4. 高质量匹配的肿瘤和血浆样本分析显示，50%的患者结果一致，而分别有29%和21%的突变仅在有组织的样本或血液样本中检测到。
5. 这些发现与其他涉及转移性NSCLC患者的类似研究结果一致。
6. BFAST试验的C队列将阿替利珠单抗与化疗作为不可切除、晚期NSCLC患者一线治疗进行了比较，这些患者的特征是bTMB截断值≥10 mut/Mb，其中大多数（472名中的291名）bTMB ≥16 mut/Mb。
7. 尽管该试验在bTMB ≥16 mut/Mb人群中未达到PFS的主要终点（HR 0.77，95% CI 0.59–1.00；P = 0.053），但该亚组18个月的PFS和OS均倾向于阿替利珠单抗。
8. 有趣的是，当使用F1L CDx检测法对bTMB进行评估，并以等效的截断值bTMB ≥13.60 mut/Mb进行探索性分析时，阿替利珠单抗显著改善了PFS，与化疗相比（4.9个月对4.2个月，HR 0.71，95% CI 0.52–0.97；P = 0.029）。
9. 进一步的研究应旨在解决bTMB主要在晚期疾病患者中的实用性，对于这些患者，获取足够的组织进行分子检测可能很困难，而ctDNA水平与早期肿瘤相比，更可能足够用于NGS。

para

1. TMB的重要里程碑是在FDA加速批准pembrolizumab用于治疗成人和/或儿童患者，这些患者患有任何TMB高(≥10 mut/Mb)不可切除和/或晚期实体瘤，并且在先前治疗后进展且没有可用的满意替代治疗选项。
2. 这一决定是基于单臂Keynote-158试验的结果，并仿效了早期以MSI-H作为生物标志物的类似批准。
3. 尽管这种不考虑肿瘤类型的批准具有开创性，但这一决定在全球范围内引发了多场有争议的讨论，最终导致EMA拒绝了批准申请。
4. 对Keynote-158的批评主要有三个方向。
5. 首先，该试验没有包括控制臂，并且缺乏对生存终点的分析；在FDA批准时，仅分析了反应率。
6. 因此，继续需要进行随机试验，以证明ICIs在未选择的TMB高肿瘤患者中改善生存结果。
7. 其次，大多数特定癌症类型的样本量较小，特别是对于尚未有ICIs组织特异性批准的癌症类型。
8. 第三，FDA批准中指定的10 mut/Mb的截断值需要进一步验证，因为更高的截断值与反应率的逐渐改善相关。

Theoretical background

para

1. 全外显子测序(WES)和大范围测序板(≥1 Mb)是测量肿瘤突变负荷(TMB)最常用的方法，前者通常基于匹配的肿瘤和非恶性DNA的测序，而后者通常基于仅肿瘤的测序(框1)。当基于WES数据计算时，TMB可以直接测量并报告为错义突变的总数。与基于测序板的方法不同，这种方法直接测量TMB，无需对被调查序列进行抽样，因此不会引入随机误差。另外，基于测序板数据的分析提供了一个报告为测序区域mut/Mb的TMB，导致需要对WES和不同大小的测序板之间进行比较。当使用测序板测序时，通常在TMB计算中包括除错义突变之外的其他非同义突变类型，以增加调查的突变总数，从而减少随机误差。同时，已知的致癌变异从计算中排除，以防止由于偏向癌症特异性测序板的设计（富含致癌基因和肿瘤抑制基因）导致的TMB过高估计。一项涉及非小细胞肺癌(NSCLC)患者队列的桥接研究显示，通过WES检测到的199个错义突变负荷对应于使用基于测序板的F1 CDx检测法检测到的包括所有外显子突变的10 mut/Mb的TMB。在这项研究中，将TMB分类为低或高的总体一致性水平为84%。这样的转换因子也可以推广到其他商业和学术测序板。

para

1. 错义突变是癌症细胞外显子中存在最丰富的突变类型，同义突变、无义突变和插入/缺失变异分别平均占错义突变负担的40%、10%和5%，尽管这些比例在癌症类型内部和之间有相当大的差异。
2. 只有非同义突变，即导致蛋白质氨基酸序列改变的突变，会增加新抗原负担，这支持将同义突变排除在肿瘤突变负荷（TMB）之外。
3. 此外，尽管插入/缺失变异较为罕见，但它们通常比错义突变更具免疫原性，这表明插入/缺失变异和错义突变负担可能值得作为单独的指标或作为加权指标组合的一部分进行探究。

para

1. TMB包括在癌症发病前积累的任何体细胞突变，以及随时间演化的众多癌细胞克隆中的突变。
2. 在起源于高度自我更新组织的癌症中，如慢性淋巴细胞白血病、结直肠癌和卵巢癌，估计有超过一半的体细胞突变发生在肿瘤启动之前。
3. 特定的病因学因素和病变机制可以在肿瘤演化的不同阶段起作用（图1a）。
4. 因此，TMB在不同癌症类型之间和内部都具有很高的变异性。
5. 为了说明TMB在癌症类型内部和之间的变异性，我们绘制了TCGA队列中每种肿瘤类型的错义突变和插入缺失负担图（图2）。
6. 散点图显示高TMB与与DNA修复缺陷相关的突变（主要发生在结直肠癌、胃癌和子宫内膜癌）以及与烟草烟雾暴露（主要是肺癌）和UV光暴露（黑色素瘤）相关。
7. 具有突变导致校对缺陷（PRD）的肿瘤具有极高的错义突变负担（中位数895，2.5–97.5%分位数25–11,100）和较高的中位数插入缺失负担（12，0–429）。
8. 具有错配修复缺陷（MMRd）的肿瘤具有非常高的错义突变负担（543，112–9,000）和极高的插入缺失负担（82，0–445）。
9. 相比之下，具有同源重组修复缺陷的肿瘤的错义突变负担和插入缺失负担较低（90，23–707和5，0–27），而在DNA修复能力强的肿瘤中更低（37，4–474和2，0–16）。
10. 高TMB特别可能出现在暴露于强力诱变剂，如烟草烟雾和UV光的肿瘤中，如吸烟相关的肺癌和皮肤黑色素瘤。
11. 极高的TMB也可见于具有MMRd和PRD的肿瘤，这一类别主要包括结肠、直肠、胃和子宫内膜的腺癌。

Fig. 2: Pan-cancer analysis of missense mutation and indel burden.

[图片上传失败...(image-7ea8e8-1728378050263)]

Box 1 Definition and measurement of tumour mutational burden

• 这项分析是使用来自癌症基因组图谱队列168的公开可用数据进行的。垂直线标记了199个错义突变的截止点，当使用全外显子测序数据进行分析时，将TMB高与TMB低肿瘤区分开。
• 图a展示了按癌症类型分类的错义突变和插入缺失负担。图b展示了按DNA修复缺失类型分类的肿瘤。
• 错配修复缺失（MMRd）是通过分析至少具有100个错义突变的肿瘤中C(C > A)N、G(C > T)N和Y(A > G)N信号突变的比例来确定的，具体描述见其他文献169。
• 校对缺失（PRD）是通过检测POLE或POLD1中的有害突变来确定的。
• 同源重组修复缺失（HRD）是基于至少42的HRDsum得分来确定的。
• COAD/READ，结直肠腺癌；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；SKCM，皮肤黑色素瘤；STAD，胃腺癌；UCEC，子宫体子宫内膜癌。
• 肿瘤突变负荷（TMB）通常定义为癌细胞基因组编码DNA序列（CDS）中体细胞错义突变的总数，可以通过全外显子组测序（WES）对配对的肿瘤和非恶性样本进行测量。体细胞变异的检测受到变异等位基因频率（VAF）的影响，VAF定义为支持该变异的高质量读数与该基因组位置的总读数之比。肿瘤纯度定义为组织样本中癌细胞占总细胞数的百分比。肿瘤样本中存在的非肿瘤细胞（如基质、免疫和非恶性组织细胞，携带野生型等位基因）都会影响肿瘤纯度，并强烈影响任何感兴趣的突变的VAF。因此，肿瘤纯度有限会导致检测到的VAF较低，VAF过滤后通过的突变数量减少，从而导致TMB测量的偏差。癌症基因组图谱（TCGA）队列中不同肿瘤纯度水平的模拟表明，肿瘤纯度≥40%时可以控制TMB测量中的偏差。在临床研究和收集队列的回顾性分析中，199个突变的临界值被证明可以为患者接受免疫检查点抑制剂（ICIs）的疗效提供分层依据。这个199个CDS错义突变的临界值可以与基于面板测序的TMB的10个突变/Mb临界值对应。然而，来自全国TMB协调研究的数据表明，TMB测量和最适当的临界值在不同检测方法中有所不同，这些研究建议了用于对齐的方法和工具。
• 面板测序TMB（psTMB）通过测序CDS的限制区域来提供TMB的近似值。psTMB通常包括各种类型的突变（包括错义突变、无义突变、插入缺失突变和剪接位点突变），但排除了同义突变和已知的致癌突变。与≥10个突变/Mb的临界值一起，FDA已批准psTMB作为一种预测性生物标志物，用于肿瘤不可知论的帕博利珠单抗（pembrolizumab）治疗那些没有可用标准治疗方案的患者。虽然不进行配对非恶性DNA测序也可以测量psTMB，但这种方法可能会降低psTMB测量的准确性。如果缺少配对的非恶性参考，需要使用SNP数据库和生物信息学算法来近似过滤生殖系变异，这可能会导致错误分类。仅调查CDS的限制区域会引入psTMB测量固有的随机误差。该随机误差（以psTMB的变异系数表示）与面板大小的平方根和TMB的平方根成反比，这意味着面板大小≥1Mb时才能实现准确的TMB量化。然而，对于1.34Mb的面板和TMB为20个突变/Mb的肿瘤，随机误差超过了来自生殖系突变过滤、技术变异和生物学变异的其他误差类型的影响。因此，当前使用约1Mb面板观察到的pTMB的准确性可以通过使用覆盖>2Mb的面板或WES来提高。多个国家的倡议已经尝试在不同的测序面板、实验室和生物信息学流程中协调和标准化psTMB测量。
• 祖籍校正的TMB通过对特定祖籍群体中的TMB进行线性重新校准实现，该群体使用了仅肿瘤测序。此校正考虑了基于白人患者SNP数据库的生物信息学过滤引入的偏差。
• 血液TMB提供了一种非侵入性替代组织TMB的方法，适用于难以或无法获得足够组织用于分子检测的情况。血液TMB的另一个潜在优势是能够分析与疾病相关的所有基因组变异，包括转移瘤，同时避免与单一部位肿瘤活检采样相关的偏差。这种方法的缺点包括依赖于循环肿瘤DNA的释放，以及检测全游离DNA中突变所需的高水平测序覆盖率。
• 肿瘤插入缺失负荷（TIB）是肿瘤基因组CDS中插入缺失突变的总数。在大多数肿瘤中，移码突变远比框内插入和缺失突变常见，并构成TIB的大部分。例如，在TCGA队列中的肿瘤中，TIB的84%是移码突变，而框内插入和框内缺失分别仅占此指标的2%和14%。TMB和TIB应分开确定，因为移码插入缺失突变的免疫原性远高于替代突变，并且在相同的癌症类型中，不同类型的突变比例差异显著。

Measurement and confounders

para

1. 肿瘤的TMB可以通过对同一患者取得的配对肿瘤和生殖细胞样本进行全外显子测序来确定。
2. 或者，可以通过目标面板测序方法近似计算TMB，这种方法仅能评估编码DNA序列（CDS）的一部分。
3. 在常规临床实践中，通常只对肿瘤材料进行面板测序，这是由于更简单的物流以及避免额外的生殖细胞测序所需的努力和成本。
4. 相比之下，增加生殖细胞测序需要实施平行的流程以及相关的物流，以血液或非恶性组织样本确保在临床相关的时间框架内完成。
5. 在只有肿瘤的情况下，需要使用SNP数据库（针对常见SNP）和生物信息学算法（针对罕见和/或私人SNP）来过滤掉生殖细胞突变，而不是依赖由非恶性样本定义的基线来进行体细胞变异调用。

para

1. 除了不同的实验室检测方法外，还可以使用不同的TMB定义和不同的生物信息学算法来确定TMB（框1）。
2. 例如，在许多全外显子测序（WES）研究中，只包括错义突变定义已被使用，而在大多数基于panel的测序方法中，TMB计算包括了更广泛的突变类别。
3. 使用的实验室和生物信息学方法的不同提出了一个重要的疑问，即不同检测方法之间的可比性，并呼吁努力弥补不同方法之间性能上的任何差距。
4. TMB测量的协调一致已经在由癌症研究之友和德国病理学质量（QuIP）倡议进行的研究中得到解决。
5. 在比较了使用不同检测方法和在不同实验室获得的TMB结果之后，可以得出以下一般性结论：应该在共识指南中定义TMB测量的最佳实验室和生物信息学实践；应该使用通用参考标准来校准TMB，以确保不同检测方法和不同实验室之间TMB截止值以及任何相应的患者分层准确性的最佳可重复性。
6. 2023年发表的数据表明，使用WES测量的TMB在德国五个中心之间可以实现良好的实验室间可重复性（Pearson R值为0.97–0.99）。

para

1. TMB测量的主要潜在混杂因素包括生物学变异性、技术变异性、肿瘤纯度不足、仅对肿瘤组织进行测序时对生殖细胞突变的精确过滤以及进行panel测序时的随机变异性。
2. 一些研究通过分析从同一肿瘤获得的两个或更多组织块来研究TMB的生物学变异性。
3. 对于NSCLC患者的样本，所有组织块中TMB分类的一致性（在10 mut/Mb的截止点处为高与低）在85-90%的肿瘤中观察到。

para

1. 技术变异性指的是在重复分析同一DNA样本后出现的TMB差异。
2. 在美国癌症研究朋友会与德国QuIP TMB研究中，对TMB的实验内和实验室间技术变异性范围进行了调查。
3. 为了成功和准确测量TMB，实验室相关因素和生物信息学相关因素都至关重要。
4. 突变调用需要灵敏，但同时需要特异以区分突变和可能的测序人工产物，例如，由于福尔马林固定可能导致的人工产物。
5. QuIP研究中的研究者确定以下因素是为成功测量TMB的关键：实施读取去重策略以区分来自PCR重复的不同DNA链的读取，获取具有足够肿瘤纯度和足量DNA的样本。

para

1. 变异等位基因频率（VAF）被定义为支持变异的读段数与调查序列位点的总读段数之比。
2. 在癌症组织中，VAF受样本的肿瘤纯度、突变的克隆性以及受影响和未受影响的基因拷贝数的影响。
3. 为了进行变异调用，需要设置一个VAF阈值，以确保敏感和特异的变异检测。
4. 在临床实践中，VAF阈值通常被设置为5%，这样在测序覆盖度为200×时，所有被调用的变异至少由10个读段支持。
5. 只有高于VAF阈值的变异才被包括在肿瘤突变负荷（TMB）的计算中。

para

1. 对肿瘤纯度对TMB测量的影响评估表明，在肺腺癌、肺鳞状细胞癌、尿路上皮癌和其他癌症类型患者的样本中，肿瘤纯度与TMB测量值存在显著的正相关关系。
2. 考虑到这些观察结果，我们使用计算机模拟来模拟肿瘤纯度对检测TMB高肿瘤能力的影响（见图3）。
3. 较低的肿瘤纯度会导致对VAF的估计值降低，并且被认定对TMB有贡献的变异数量也会减少。
4. 因此，我们模拟了较低的肿瘤纯度，考虑了肿瘤基因在突变位置处的拷贝数，并随后评估了变体信号是否保持在VAF阈值以上以便纳入TMB（此处为5%）。
5. 总体而言，应用模拟的肿瘤纯度降低导致VAF降低，进而导致TMB降低。
6. 当模拟的肿瘤纯度为60%、40%和20%并与80%的参考值进行比较时，中位TMB分别降低了2%、10%和32%。
7. 对于TMB估计最差的10%纯度肿瘤样本，TMB分别降低了12%、35%和77%或更多。
8. 将这些结果与199个突变的标准值相关联，在泛癌症队列中检测高TMB的敏感性分别为肿瘤纯度为60%、40%和20%的98%、90%和62%。
9. 对于头颈癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌和皮肤黑色素瘤患者的样本，肿瘤纯度为40%时，检测高TMB的敏感性分别为80%、89%、92%和91%。
10. 总结来说，对于至少60%肿瘤纯度的样本，TMB测量是准确的，检测高TMB的敏感性接近100%。
11. 相比之下，当肿瘤纯度低于40%时，TMB被大幅低估，导致敏感性降低，相当一部分可能从ICIs获益的患者被漏诊。
12. 因此，选择用于TMB测量的组织样本应确保最低肿瘤纯度为60%，绝对不能低于40%。
13. 开发能够准确校正低肿瘤纯度TMB读数的生物信息学方法是减轻低样本纯度时TMB高肿瘤漏检的一种潜在方法。
14. 已经开发出一种此类方法，使用这种方法生成的校正TMB在预测临床结果方面优于传统的TMB，当回顾性地应用于接受ICIs的患者队列时50。
15. 改进低纯度肿瘤样本处理的其它潜在方法包括通过增加测序深度提高突变检测的敏感性，或者使用克隆TMB（cTMB），这是一个只包括高VAF的骨干突变的指标，作为一种潜在的更稳健的总TMB替代指标。

Fig. 3: Influence of tumour purity on TMB measurement.

[图片上传失败...(image-dda657-1728378050263)]

1. 使用来自癌症基因组图谱（TCGA）子队列的公开数据进行了不同肿瘤纯度水平的模拟，这些肿瘤的纯度≥80%，且有可用的来自基因分型的拷贝数数据（n = 4,900）。
2. 我们模拟了具有均质肿瘤纯度的队列，这些纯度从10%到80%不等。
3. 将10–70%的肿瘤纯度与80%的肿瘤纯度进行了比较，后者作为参考。
4. 具有模拟纯度q的肿瘤的肿瘤突变负荷（TMB）计算为变体等位基因频率（VAF）在纯度=q≥5%时的错义突变数量，其中模拟肿瘤的变体VAF与原始VAF的关系为VAF（纯度=q）= d(p)/d(q) × VAF（纯度=p），d(x) = 1 + 2/CN × (1/x – 1)。
5. 在这里，CN是肿瘤在突变区域内的拷贝数。
6. a，相对于参考，检测到的低纯度肿瘤的TMB（以%）。
7. 框表示10%、25%、50%、75%和90%的分位数。
8. b，检测TMB高（≥199错义突变）肿瘤的敏感性相对于80%参考。
9. 条表示95%置信区间。
10. c，特定癌症类型中检测TMB高肿瘤的敏感性（提供的数据是至少有10个TMB高肿瘤的实体）。
11. BLCA，膀胱尿路上皮癌；BRCA，乳腺癌浸润性癌；CESC，宫颈鳞状细胞癌和子宫内膜腺癌；COAD，结直肠腺癌；GBM，胶质母细胞瘤；HNSC，头颈鳞状细胞癌；LIHC，肝细胞肝癌；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；PANCAN，泛癌症图谱，包括TCGA分析的33种癌症类型；SKCM，皮肤黑色素瘤；UCEC，子宫内膜癌。

para

1. 生物信息学变异过滤是缺乏成对非恶性DNA时的必要步骤，也是技术变异性的另一个来源。
2. 常见的单核苷酸多态性(SNPs)可以很容易地根据SNP数据库（如gnomAD51）被过滤掉。
3. 然而，由于依赖于使用检测到的变异等位基因频率(VAF)作为输入的大约算法，罕见或私有的SNPs的过滤更易出错。
4. 此外，已有研究证明患者的祖先会影响生物信息学生殖细胞系过滤方法的准确性，导致非白人患者的肿瘤突变负荷(TMB)值更高38。
5. 这种偏差可以用用于生殖细胞系过滤的SNP数据库的内容来解释，包括来自白人患者的数据集比来自其他人的数据集更多。
6. 为了纠正这种偏差，研究者们根据患者祖先分层，利用线性模型重新校准了仅肿瘤测序设置中测量的TMB，该模型将仅肿瘤TMB和肿瘤-生殖细胞系TMB相关联52。
7. 经过校正的祖先TMB在将两个回顾性队列分层以从ICIs中获益方面，优于传统的TMB。
8. 尽管如此，在分层后，10 mut/Mb截止点的TMB仍然具有预测性，并在非洲、欧洲和亚洲或其他背景的大型回顾性队列研究中达到统计学显著性53。
9. 这些研究支持这样一个观点，即10 mut/Mb截止点的TMB可以跨血统预测ICIs的益处。
10. 然而，目前用于生殖细胞系过滤的方法和数据库以及应用于特定患者群体的TMB截止值可能并非最理想，这个问题值得进一步研究。

para

1. 当应用于面板测序数据时，TMB 需要从分析过的 CDS 部分进行近似，这意味着它是一个样本的估计值，而不是一个精确的评估。
2. 因此，会引入一个与面板大小的逆平方根和提供的 TMB 读数的逆平方根成比例的随机误差。
3. 对于目前在临床研究和临床实践中使用的小面板，与面板大小相关的随机误差可能是相当大的。
4. 利用误差建模，结合生物学误差、技术误差、遗传变异的假阳性和假阴性检测以及随机误差的数据，分析了不同混淆因素对 TMB 测量变异性的贡献程度。
5. 对于使用大面板分析的 TMB 为 0–20 mut/Mb 的肿瘤，面板大小是影响测量变异性的最主要来源，占总 TMB 方差的超过一半。
6. 通过从未接受 ICIs 的患者的 WES 数据中抽取样本模拟面板测序，使用小面板（覆盖 <0.5 Mb 的 CDS）测量的 TMB 值比使用完整的 WES 数据集测量的 TMB 的预测价值要低，尽管即使是使用大面板（1–1.5 Mb 的 CDS）测量的 TMB 值在数值上也比使用 WES 测量的 TMB 的预测价值要低。
7. 因此，强烈建议至少包含 1 Mb CDS 的面板用于 TMB 测量，而使用甚至更大的面板的效果值得进一步的临床研究。

Limitations of clinical use

para

1. 多项研究已经证明了TMB与ICIs的应答之间存在正相关关系，以及与接受化疗的患者相比，TMB高的肿瘤患者在使用ICIs后的生存结果有所改善。
2. 然而，许多这些研究提供的是广泛TMB层次上的平均结果数据，并且/或者分析了包含多种不同肿瘤类型患者的多个研究的数据。
3. 其他专注于TMB与特定肿瘤类型患者对ICIs应答相关性的研究，常常无法确认在更多样化队列中观察到的积极关联，这表明TMB的临床效用可能存在局限性。

para

1. TMB是一个连续变量，这使得它在临床决策中分类存在固有的挑战。
2. 特别是，10 mut/Mb的截止值是否最优且在所有癌症类型中同样有效，以及肿瘤的TMB接近与远离这一截止值对临床结果的影响，需要进一步的研究。
3. 通过比较TMB高（例如前20%分位数）与TMB低肿瘤，以及将TMB作为一个连续变量应用，研究者报告了大多数癌症类型接受ICIs治疗的高或更高TMB患者的总生存期（OS）显著改善，而在未接受ICIs治疗的患者中，TMB并没有成为普遍的预后特征。
4. 这些多变量生存分析为多种癌症类型包括非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤、头颈癌、结直肠癌、食管胃癌和尿路上皮癌的TMB与OS之间建立了显著的正相关，尽管有一些例外，如胶质瘤。
5. 即使当黑色素瘤或NSCLC患者的数据被排除在分析之外，TMB作为一个连续变量与每种组织学的 top 20%以及改善OS之间的统计学显著相关性仍然存在。
6. 本研究支持的观点是，应用更高且特定于癌症类型的TMB截止值可能比单一固定阈值更好地对患者进行分层，从而从ICIs治疗中获益。
7. 在Keynote-158中，支持pembrolizumab的实体无关批准，报告了TMB分别为<10、10–13和>13 mut/Mb的肿瘤的响应率为6.7%、12.5%和37%，显示了在10 mut/Mb截止值下响应者分离的不完全。
8. 这一截止值是基于早期涉及NSCLC患者的回顾性研究预先指定的。
9. 进一步验证最优的、可能是特定于癌症类型的TMB截止值，以更准确的选择最有可能从ICIs治疗中获益的患者是必要的。

para

1. 在之前讨论的分析中，比较了不同的TMB截断值，结直肠癌（CRC）患者中前20%的TMB截断值特别高（52 mut/Mb），这可能反映了MSI-H在这个亚组中的流行性。
2. 这项研究强调了MMRd和POLE/POLD1突变状态对从ICIs获益的预测价值，以及与环境致癌物（如紫外线辐射和烟草）暴露相关的超突变肿瘤。
3. 然而，专注于MSI-H肿瘤的研究发现，一些患者对ICIs存在原发性耐药，表明MSI-H在这个背景下是一个不完美的生物标志物。
4. 当从分析中去除MSI-H肿瘤时，10 mut/Mb的TMB截断值仅在几种癌症类型中预测获益，包括转移性头颈癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤，但在其他几种恶性肿瘤中则不是。
5. 相比之下，其他几项涉及MSI-H癌症患者的研究显示，TMB或indel突变负荷与ICI反应之间存在可测量的正相关关系。
6. 在一项单中心的事后分析中，作者提出，对ICIs无反应的MSI-H和MMRd CRC亚组可能反映了MSI-H或MMR状态的误诊。
7. MSI-H/MMRd肿瘤的TMB远高于具有熟练DNA修复的肿瘤；因此，TMB的评估可能被用作一种质量控制方法，并支持避免在此背景下误诊。
8. 总之，目前以TMB截断值≥10 mut/Mb的肿瘤不可知FDA加速批准派姆单抗可能过于宽泛，这表明需要考虑的不仅仅是绝对TMB，还有基础癌症类型。

para

1. TMB的预测价值可能取决于所考虑的具体治疗方案，并且观察到在PD-1–PD-L1轴的阻断中加入CTLA4阻断时，其预测价值仍然存在。
2. 相比之下，对于接受ICIs和化疗联合治疗的患者，TMB可能会完全失去其预测价值，正如在Keynote-189、Keynote-407和Keynote-21研究中招募的NSCLC患者所观察到的那样。
3. 这个问题不仅特定于TMB，还影响其他几种免疫相关生物标志物，包括基于组织的（如PD-L1）和基于血液的生物标志物（如淋巴细胞与中性粒细胞比率以及晚期肺癌炎症指数），当化疗与ICI同时进行时，所有这些生物标志物都会失去其预测能力。
4. 通常，当两种疗法结合使用时，判断反应和抵抗是否与化疗、ICIs或两者都相关变得相当困难，这使得生物标志物分析更具挑战性。

para

1. 总之，TMB在预测ICIs益处方面既具有有限的敏感性也具有特异性。
2. 为了缓解这些局限性，研究了几种策略：用肿瘤新抗原负担（TNB）或HLA校正的TMB替代TMB，以解决基础突变的变异性免疫原性；
3. 细化经典TMB，以包含某些新概念，包括cTMB、持久性TMB（pTMB）和突变特征；
4. 将TMB与其他生物标志物相结合，例如PD-L1、MSI-H、STK11/KEAP1突变、派生淋巴细胞与中性粒细胞比率及/或免疫相关基因表达特征，以提高接受化疗免疫治疗方案的患者的TMB预测有效性。

Fig. 4: Concepts for the refinement of tumour mutational burden.

[图片上传失败...(image-e75e4b-1728378050263)]

• 遗传改变的免疫学相关性受其表达、突变蛋白处理成新肽段及其后续呈递以及处理过的新肽段的识别特征所调控。
• 这里描述的亚组考虑了这些特性，以得到总肿瘤突变负荷(TMB)的精细版本。
• 克隆性TMB关注的是干性突变，这些突变是所有癌细胞共有的改变。
• 因此，克隆性新抗原可以用来识别起源于特定肿瘤的所有细胞。
• 表达性TMB捕获的是表达基因的突变负荷，并且只包括在mRNA水平上显现的改变。
• 肿瘤新抗原负荷包括由表达的体细胞突变产生的新表位，这些突变导致肽序列改变，并且预计能被免疫系统识别。
• 彩色区域对应于表达的(黄色)，新抗原性的(红色)和剩余的突变(灰色)。
• 实色和浅色阴影分别指的是克隆性和亚克隆性突变。
• DNV，二核苷酸变异；pTMB，持续性TMB；SBS，单碱基替换；SNV，单核苷酸变异；SV，结构变异。

Tumour neoantigen burden

para

1. TMB 被用作新抗原存在的替代指标，尽管并非所有突变类型在产生免疫原性新抗原的能力上都是等效的。
2. 例如，与仅影响单个氨基酸的错义突变不同，移码突变会彻底改变蛋白序列直至下一个终止密码子，因此很可能会产生更多的新表位。
3. 移码突变可能导致产生几乎随机的肽序列，这些序列与遗传表位的高度不相似可能为特定的抗肿瘤免疫反应提供机会，尽管需要考虑这些改变产生的 mRNAs 是否容易受到无义介导的降解或其他转录后过程的影响。
4. TNB 通过具体量化导致免疫原性新肽或免疫原性新肽总和的突变子集来精炼 TMB。

para

1. 体细胞突变触发特异性免疫识别癌细胞，这些癌细胞展示它们相关的新的抗原，尽管抗原展示依赖于完整的抗原处理和展示途径，以及充足的T细胞启动、扩展和抗原识别（图1b-d）。
2. 肿瘤基因组中CDS的非同义突变导致突变蛋白的表达，这些蛋白可作为新抗原发挥作用。
3. 突变蛋白首先必须被蛋白酶体处理，产生新的肽段，这些肽段可以被MHC I类或II类分子展示，并促进肿瘤特异性免疫反应。
4. MHC I类分子由所有有核细胞表达，并将长度为8-12个氨基酸的肽段展示给CD8+ T细胞。
5. MHC II类分子主要由专业的抗原呈递细胞（如树突状细胞）表达，并将长度为13-25个氨基酸的肽段展示给CD4+ T细胞。
6. 为了激发抗肿瘤免疫反应，新抗原需要：表达、处理并运输到内质网；由MHC分子展示并被T细胞识别。
7. 为了解决这三个步骤，已经开发出了预测抗原处理、抗原结合亲和力和抗原识别的计算机模拟方法。
8. 生物信息学预测工具可以使用机器学习以及结合亲和力数据和/或质谱识别的HLA释放配体作为训练数据，成功解决前两个步骤。
9. 关于抗原处理或抗原处理与结合亲和力结合的大型数据集是公开可用的，例如，来自免疫表位数据库（IEDB）、SysteMHC Atlas和蛋白质组学识别数据库（PRIDE），而关于抗原识别的数据则因缺乏有效的高通量分析方法而较少。

para

1. 为了说明计算型新抗原预测的最新进展，我们对包含在TCGA泛癌症队列中的肿瘤中存在的突变进行了分析，使用了四种已发布的新抗原预测工具，这些工具都基于人工神经元网络，用于预测肽与MHC I类分子的结合（图5）。
2. NetMHC 4.0和MHCFlurry 1.2是针对每种HLA类型分别训练的基因特异性预测器，这些工具通过半最大抑制浓度（IC50）预测抗原结合亲和力，并基于500 nM的阈值将结合抗原与不结合抗原区分开来。
3. 相比之下，MHCPan 4.1和MHCFlurry 2.0是泛癌症预测器，以HLA和肽序列作为输入进行训练。
4. 对于这些工具，分析了两个截止值，分别对应弱结合者（截止值0.5%）和强结合者（截止值2%）。
5. 对于所有分析的 新抗原预测方法，在TCGA泛癌症队列中，肿瘤非自体突变负担（TNB）和肿瘤突变负担（TMB）之间的相关性为中等至强（Spearman相关系数0.65–0.79）。

Fig. 5: Immunogenicity of mutations and tumour neoantigen burden.

[图片上传失败...(image-df6ade-1728378050262)]

• 对来自TCGA泛癌症队列数据中的突变进行了分析，并使用四种新抗原预测算法评估了MHC I类的呈递情况。
• a，根据移码和非移码突变分开的绑定亲和力或洗脱配体排名分数的分布。
• 垂直线表示与HLA I类分子结合的截止值。
• 对于NetMHC 4.0和MHCFlurry 1.2，截止值在IC50 = 500 nM。
• 对于NetMHCPan 4.1和MHCFlurry 2.0，分析了对应于弱结合剂（WBs，0.5%）和强结合剂（SBs，2%）的两个截止值。
• b，分别显示错义突变、移码突变、非移码缺失和非移码插入的MHC I类呈递突变百分比。
• 所示数据为所有分析肿瘤的平均值和标准偏差。
• 肿瘤新抗原负荷（TNB）与肿瘤突变负荷（TMB）呈中等至强相关（泛癌症队列中的Spearman相关系数：NetMHC 4.0：0.67，MHCFlurry 1.2：0.65，NetMHCPan 4.1 WB：0.79，NetMHCPan 4.1 SB：0.68，MHCFlurry 2.0 WB：0.79和MHCFlurry 2.0 SB：0.79）。
• c，顶部，每种癌症类型中TMB高（≥199错义突变）和TNB高（将TMB截止值转移到TNB以最大化约登指数）的肿瘤百分比。
• 误差线（最小至最大百分比）指的是六种新抗原预测方法的结果。
• 底部，相对于所有突变（TNB/TMB）的呈递突变百分比。
• 所示数据为每种特定肿瘤类型的平均值。
• ACC，肾上腺皮质癌；BLCA，膀胱尿路上皮癌；BRCA，乳腺浸润性癌；CESC，宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌；CHOL，胆管癌；COAD，结直肠腺癌；COADREAD，结直肠腺癌；DLBC，弥漫大B细胞淋巴瘤；ESCA，食管癌；GBM，胶质母细胞瘤；HNSC，头颈鳞状细胞癌；KICH，肾嫌色细胞癌；KIRC，肾透明细胞癌；KIRP，肾乳头状细胞癌；LAML，急性髓系白血病；LGG，脑低级别胶质瘤；LIHC，肝细胞癌；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；MESO，间皮瘤；OV，卵巢浆液性囊腺癌；PAAD，胰腺腺癌；PANCAN，泛癌症图谱，包括TCGA中分析的所有33种癌症类型；PCPG，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤；POLE，聚合酶ε；PRAD，前列腺腺癌；SARC，肉瘤；SKCM，皮肤黑色素瘤；STAD，胃腺癌；TGCT，睾丸生殖细胞肿瘤；THCA，甲状腺癌；THYM，胸腺瘤；UCEC，子宫内膜癌；UCS，子宫肉瘤；UVM，葡萄膜黑色素瘤。
• MSI，微卫星不稳定；MSS，微卫星稳定。

para

1. 为了模拟基于TNB的分类系统，并将其与已建立的基于TMB的分类系统进行比较，可以将TMB的截止值199个错义突变（对应于10 mut/Mb）通过最大化泛癌症队列中的约登指数（敏感性和特异性的总和）转换为TNB的截止值。
2. 对于所有研究的算法，预测由MHC I每肿瘤呈现的突变百分比在癌症类型之间有显著差异（所有P < 1 × 10^-100）。
3. 因此，对于某些癌症类型，被分类为TMB高和TNB高的肿瘤百分比有显著差异（图5c）。
4. 因此，应用泛癌症截止值对TNB而不是TMB进行分类，导致肿瘤分类上有实质性差异，因此，在选择接受ICIs的患者上也存在差异。

para

1. HLA校正的TMB涉及根据癌症细胞中可用的HLA等位基因对TMB进行校正，以筛选出潜在的HLA等位基因丢失后的突变。
2. 在独立队列中，接受ICIs治疗的NSCLC或黑色素瘤患者中，HLA校正的TMB在预测PFS方面优于经典TMB，尽管还需要进一步的数据来证实HLA校正TMB在这些癌症及更广泛领域的临床效用。
3. 差异抗原性指数、MUC16新抗原和neoantigen-fitness模型都被提出作为ICI反应的预测标志物，尽管在包括超过1000名黑色素瘤患者以及头颈、尿路上皮、肾、肺和结直肠癌患者的后续荟萃分析中，这些标志物均未被证实。
4. neoantigen-fitness模型的扩展版本，将识别（非自身抗原）和耐受（自身抗原）视为两个竞争特性，能够预测长期存活的胰腺癌患者的免疫编辑。
5. 在TESLA联盟进行的一项研究中，包括新抗原呈现和识别特征在内的指标，在一组接受抗PD-1抗体治疗的55名黑色素瘤患者中，优于仅基于新抗原呈现的指标。
6. 尽管这是首个定义包括新抗原识别特征的预测生物标志物的研究之一，但结论受到仅研究来自6个肿瘤的608个新表位的限制。
7. I期和II期临床试验为使用包含编码个性化新抗原的mRNAs的疫苗治疗胰腺癌或黑色素瘤患者提供了首个临床原理证明。
8. 两项研究都依赖于计算预测最具潜力新抗原，并证明这些方法是可行的并且可能有效，表明迫切需要进一步的发展。

para

1. 到目前为止，针对ICIs靶点的研究大多集中在使用DNA测序检测到的肿瘤特异性体细胞突变产生的 neoantigens 上。尽管如此，还存在其他大类的肿瘤特异性和肿瘤相关抗原，它们可能通过RNA测序和/或其他‘omics’技术进行剖析，这值得深入研究。
2. 这些抗原来源于基因组的‘暗物质’，描述的是无法通过全外显子测序（WES）结合体细胞变异调用生物信息学工作流程检测到的改变，包括由基因融合产生的嵌合蛋白、新的剪接异构体、RNA编辑的转录物和可移动元素（其他地方有详细评论）。
3. 在过去的几年里，内源性反转录病毒表达被建议作为预测生物标志物和免疫治疗靶点，用于患有多种癌症类型的患者，包括肾透明细胞癌和NSCLC。
4. 寻找免疫原性暗物质是一个激动人心的研究领域，它可能使得结合相应生物标志物开发新型免疫疗法成为可能。

para

1. 临床证据支持TNB和相关生物标志物优于TMB作为ICIs反应预测因子的优越性目前有限。
2. 目前仍在进行的计算模型开发能够准确预测强效新抗原，而这又受到可用训练数据量的限制，是导致这种局限性的一个重要因素。
3. 由于这些原因，关于T细胞识别特定新抗原的数据尤其稀缺。
4. 将需要生产和共享更多和更大的数据集，以改进新抗原预测能力，从而将TNB发展成为能够更准确预测并在临床实践中指导治疗决策的预测性标志物。

TMB modifications

para

1. 已经引入了几种与TMB相关的生物标志物，包括某些特定突变亚群，目的是优化从ICIs中获益的预测（框2）。
2. 组织样本的总TMB可以分为克隆性和亚克隆性突变的总和，前者构成cTMB。
3. 在之前提到的一项包含1000多例患者接受ICIs的大型荟萃分析中，较高的cTMB和较高的总TMB与对ICIs的改善反应相关，而亚克隆TMB不具有预测性92。
4. 尽管如此，这些结果应考虑潜在的限制因素，包括此分析基于12项已发表研究的汇总原始测序和RECIST数据。
5. 这种方法可能会引入批次效应的假象，并且受到不同癌症类型数据可用性不同以及缺乏长期终点评估的限制。
6. 两项涉及非小细胞肺癌（NSCLC）和黑色素瘤患者的研究支持ICI反应主要受cTMB驱动的假设，而亚克隆遗传多样性的更高水平可能是有害的100,101。
7. 在涉及晚期尿路上皮癌、微卫星不稳定（MMRd）胃癌和结直肠癌或NSCLC患者的研究中进一步探讨了cTMB的预测价值102,103,104。
8. 来自MMRd胃癌或结直肠癌患者的数据为cTMB优于经典TMB提供了一些证据。
9. 相比之下，其他数据并不支持使用cTMB：在黑色素瘤患者中，cTMB在预测总生存期（OS）方面并未优于总TMB105。
10. 在一项对3000多名晚期NSCLC患者接受ICIs的回顾性数据分析中，亚克隆TMB（而非cTMB和总TMB）将长期反应者与短期反应者区分开来20。

para

1. 我们和其他人之前已经表明，通过生物信息学估计的亚克隆TMB或者通过测序同一肿瘤的两个或更多样本估计的亚克隆TMB，在不同肿瘤区域之间存在显著差异，并因此以样本依赖的方式影响样本中总TMB的估计。因此，应用cTMB代替总TMB可能会减轻这种生物学变异性的影响。
2. 来自同一肿瘤的多个样本的测序和/或单细胞测序可以更深入地了解突变克隆性，尽管cTMB也可以根据单个肿瘤样本的测序数据通过生物信息学近似估计。
3. 与经典TMB相比，cTMB仅包括骨干突变，这些突变通常具有更高的VAFs，因此可以在更高的敏感性水平上检测到，潜在地提供更稳健的生物标志物。
4. 尽管提供潜在更稳健的生物标志物以及分析临床相关因素的一些研究支持cTMB，但目前整体证据水平尚不足以支持在临床应用中用cTMB取代TMB。

para

1. 作为一种TMB的修改形式，pTMB仅包括那些在肿瘤进化过程中不太可能丢失或作为获得性耐药机制而丢失的突变。
2. 因此，仅考虑位于肿瘤DNA中存在单拷贝的基因或携带多个突变等位基因的突变。
3. pTMB已被证明在预测黑色素瘤、头颈癌、间皮瘤或非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂的反应方面优于TMB。
4. 此外，持续的突变贯穿了克隆异质性的整个谱系，这表明pTMB的预测价值独立于cTMB。
5. 据我们所知，这是唯一一项研究pTMB并已有结果的研究；因此，进一步研究这一有趣的新概念是有必要的，可能会证实pTMB相对于经典TMB的预测优势。

para

1. 突变蛋白的表达是呈现相应新抗原并使免疫系统识别它们的先决条件。
2. 基于这种必要性，探究表达的TMB（eTMB）是否比传统的TMB能更准确预测对ICIs的反应是合理的。
3. 在结合全外显子测序和全转录组测序分析中，eTMB在预测接受ICIs的黑色素瘤患者的总生存期方面优于TMB。
4. 其他研究揭示了这两个生物标志物之间的强相关性，尽管eTMB相对于TMB在预测准确性上并没有改善。
5. 因此，尽管在旨在识别强效新抗原时基因表达分析是必须的，例如用于个性化疫苗接种，但在使用eTMB以及量化所需的额外分析替代TMB之前，还需要进一步研究以预测对ICIs的反应。

para

1. 突变特征最初是在2012年提出的，它涉及根据在肿瘤发生和肿瘤生长期间活跃的潜在突变过程来分解肿瘤突变负荷（TMB）。
2. 在2020年发表的一篇综述中，我们量化了特定特征对TMB贡献的程度。
3. 这项泛癌症分析揭示了与超突变和高TMB相关的主要突变过程：POLE/POLD1突变、MMRd、紫外线暴露、烟草吸烟、激活诱导脱氨酶/APOBEC的激活以及与两种类似时钟的突变过程（单碱基替换（SBS）1和SBS5）相关的过程。
4. COSMIC突变特征的当前版本（3.4）总共包括了67个SBS和23个indel特征。
5. 从临床角度来看，判断与可靶向生物改变相关的突变特征是否可以作为预测生物标志物被利用，将是重要的一步。

para

1. 突变特征已被建议作为各种特定DNA修复缺陷的生物标志物，包括MMRd（SBS6、SBS14、SBS15、SBS20、SBS21、SBS26和SBS44）、同源重组修复缺陷（HRD）（SBS3）、PRD（SBS10a–d、SBS14和SBS20）和碱基切除修复缺陷（SBS36）。
2. HRD相关的突变特征已用于识别患者，主要是乳腺癌或卵巢癌患者，他们最有可能从DNA损伤诱导剂或PARP抑制剂中受益。
3. 使用基于复杂全基因组测序（WGS）的分类器，包括更大规模的特征集，如SBSs、indels、基因重排和CNAs（如CHORD和HRDetect），可以高准确度地区分HRD缺陷癌症患者和HRD充足癌症患者。
4. 在一项对129名食管癌患者的WGS数据分析中，研究者根据SBSs和突变特征将患者进行细分，并推测HRD阳性癌症患者可能从PARP抑制剂中受益。
5. 事实上，HRD突变特征能够区分对PARP抑制剂有反应和没有反应的胃癌患者的异种移植。
6. 然而，在治疗期间和治疗后的肿瘤演变需要考虑，因为缺陷DNA修复的功能性可能会恢复，这体现在进行中和历史HRD之间的差异。
7. 先前缺陷的DNA修复机制的恢复可以作为对治疗干预施加的选择压力的响应而发生，如乳腺癌或前列腺癌患者在PARP抑制剂获得性耐药中观察到的BRCA1/2反转突变的比例。

para

1. 其次，特定的突变特征已被提议作为生物标志物，以预测免疫疗法的好处。
2. 最突出的例子是由与dMMR相关的突变特征提供的，dMMR是实体瘤中对抗ICIs反应的一个稳健且获批准的生物标志物。
3. 影响这些肿瘤对ICIs反应的因素包括高错义突变负担，特别是由于移框新抗原的高免疫原性特征而导致的高插入缺失负担。
4. 值得注意的是，在分析超过1500个胶质瘤的测序数据时，dMMR并未预测ICI反应，这可能是因为缺乏有效的克隆新抗原，而dMMR产生的许多突变是亚克隆的。
5. 烟草吸烟（SBS4）以及APOBEC激活的突变特征都与较高的新抗原负担相关，随后与NSCLC患者对抗PD-1抗体的敏感性增加相关。
6. APOBEC突变特征与ICIs疗效之间的正相关得到了进一步研究的支持，这些研究包括了实体瘤患者的混合队列。
7. 根据主要的突变特征对黑色素瘤患者进行分层显示，与其他特征相比，紫外线暴露和烷化剂亚组对ICIs的ORRs更高（包括完全反应和部分反应的比例更高）。
8. 在另一项研究中，发现ICIs对具有高活性时钟样特征SBS1的NSCLC和黑色素瘤患者疗效较差。
9. 与NSCLC相反，烟草吸烟的突变特征与头颈鳞状细胞癌患者对ICIs的反应较差相关。
10. 这些数据显示，仅凭突变特征无法以肿瘤不可知的方式预测ICI的结果。
11. 总之，除了传统的TMB外，考虑肿瘤实体和潜在的突变过程可以提供关于使用ICIs的更准确的指导。

para

1. 将突变特征作为诊断工具引入日常临床实践的一个主要障碍是需要采用广泛的测序方法以实现敏感检测。
2. 这一需求是因为将突变分类为96个特征（6种突变类型加上突变前后紧邻的碱基）的结果，这些特征需要被单独识别和计数。
3. 特征数低将增加相应的随机错误。
4. 因此，全基因组测序（WGS）是确定突变特征的最优方法，而全外显子测序（WES）的灵敏度较低，典型的基于panel的测序方法仅适用于检测高度丰富的突变特征。
5. 然而，全基因组测序伴随着更高的劳动要求、成本以及更大的数据存储和处理需求。
6. 在未来几年，这些限制可能会随着测序成本和微芯片价格的持续下降趋势而得到缓解，并且可能会为WGS和突变特征在肿瘤学实践中的更广泛应用创造机会。

Box 2 Tumour mutational burden-related biomarkers

• 克隆性肿瘤突变负荷（cTMB）包括在早期肿瘤发展过程中获得的主干突变的子集，这些突变应存在于所有癌细胞中。多区域测序提供了一种全面确定肿瘤TMB的方法。此外，特定肿瘤区域的不同亚克隆突变特征会导致同一肿瘤的总TMB值不同。对于单个肿瘤样本，总TMB可以通过生物信息学方法分解为cTMB和亚克隆TMB，但亚克隆TMB的数值可能并不代表整个肿瘤。
• 持续性TMB（pTMB）是一个新概念，包含在肿瘤演化过程中不太可能丢失的突变。这些突变包括两类：位于单拷贝数区域的突变（单拷贝类别）和位于多拷贝数区域且每个细胞有多个拷贝的突变（多拷贝类别）。在黑色素瘤、头颈癌、间皮瘤和非小细胞肺癌患者中，pTMB在预测免疫检查点抑制剂（ICI）响应方面优于传统TMB。
• 表达性TMB（eTMB）旨在解决免疫原性强度与突变表达水平之间的关系，通常基于表达水平的阈值进行实施。大多数情况下，eTMB是通过结合全外显子组测序（WES）和全转录组测序（WTS）来计算的，先在WES数据中检测突变，然后检查该突变基因在WTS数据中的表达。相比之下，基于WTS而非WES数据的突变检测已知精确度较低，部分原因是在RNA逆转录为DNA的过程中WTS流程可能出错。
• 突变特征是根据肿瘤发展过程中起作用的突变过程对总TMB进行分解。分析的突变越多，检测突变特征的灵敏度越高。为此，可以包含位于编码DNA序列内外的突变，并通过全基因组测序以最高精度确定活跃的突变特征。
• 肿瘤新抗原负荷（TNB）定义为来源于肿瘤基因组的新抗原数量。要贡献于TNB，突变必须转录为mRNA，翻译为蛋白质，处理为肽段并由MHC I类或II类呈递供T细胞识别。TNB的一个常见定义是导致至少一个新肽段的突变总数，该新肽段由至少一个HLA I类分子等位基因呈递。除了简单的体细胞突变，其他类型的基因改变，例如基因融合，也可以导致新肽段的表达并增强肿瘤免疫原性。
• HLA校正的TMB是一种考虑癌细胞中HLA等位基因丢失的概念，通过过滤可被现存HLA等位基因识别的突变来校正TMB。研究表明，HLA校正的TMB在预测接受ICI治疗的非小细胞肺癌或黑色素瘤患者的无进展生存期方面优于经典TMB。

Combinations with other biomarkers

para

1. 在黑色素瘤中，TMB已经与转录组学和免疫细胞组学数据相结合，或者与炎症基因表达特征和BRAF突变状态相结合，以创建多模式预测因子，并且这两种方法已被证明在确定可能从ICIs中受益的患者方面优于单独的TMB。
2. 一项研究的数据也表明，TMB的预测有效性取决于黑色素瘤亚型，此外，包括由MHC I和II复合物呈现的新抗原在内的多个基因组和转录组参数，可以预测ICIs的疗效。
3. 类似的方法已应用于其他癌症类型，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、尿路上皮癌或胸膜间皮瘤。
4. 因此，TMB、基因表达谱分析、肿瘤微环境分析、免疫细胞组成和标记物表达的联合考虑被认为优于单独估计TMB。
5. 这一观点与一项社区挑战的结论一致，该挑战旨在利用众包生成能够预测NSCLC患者ICIs临床结果的模型。
6. 这一倡议包括了来自59个团队的417个模型，结果表明，包括TMB和PD-L1以及可选的额外基因表达特征的模型，比仅基于TMB和PD-L1的预测效果更好。

para

1. 在另一种方法中，特定基因或通路中的体细胞突变与TMB相结合。在这方面，CIRCLE算法优于单独使用TMB，用于预测各种实体瘤患者对ICIs的反应。
2. CIRCLE是一个逻辑模型，结合了TMB、BCLAF1、KRAS、BRAF和TP53基因的突变（这些基因影响诸如MAPK和免疫调节信号通路等），以及年龄和癌症类型。
3. 截至2023年，关于高TMB（≥10 mut/Mb）对微卫星稳定（MSS）胃肠道肿瘤患者的影响，缺乏证据。
4. 为了解决这一证据的不足，研究者们开发了一个改进的TMB模型，包括16个基因的突变状态，以预测这些肿瘤患者（占大型回顾性数据集的3.29%）对ICIs的反应性。
5. 具有MSS胃肠道癌症且突变基因包含在改进的TMB签名中的患者在ICIs治疗下有更好的总生存期。
6. 这些研究支持这样的观点，即将TMB与驱动基因或其他涉及改变的致癌信号通路的基因突变相结合，可能提高预测的有效性。

para

1. 已经提出了额外的参数，用于预测微卫星不稳定性高（MSI-H）癌症患者对免疫检查点抑制剂（ICIs）的响应性。
2. 2023年发表的一项研究报道，与散发性起源相比，遗传性（如林奇综合症）的转移性MSI-H结直肠癌（CRC）患者的无进展生存期（PFS）显著改善，但总生存期（OS）没有改善，这可能与前者与后者的肿瘤突变负荷（TMB）较高有关。
3. 尽管BRAFV600E或RAF突变无法预测接受ICIs的转移性MSI-H CRC患者的PFS或OS，但更复杂的基于DNA和基于RNA的信号已被提名为预测这些患者受益的预测因子。
4. 最后，2023年发布的数据表明，在MSI-H胃癌和CRC患者中，克隆性肿瘤突变负荷而非亚克隆性肿瘤突变负荷可预测ICI的响应，这表明肿瘤内异质性的作用。

para

1. 大多数研究的数据表明，TMB、TNB和免疫细胞浸润之间存在正相关关系。
2. 然而，由TMB或TNB评估的突变诱导抗原的呈现需要抗原呈递、T细胞扩增和抗原识别的功能机制，以及允许免疫细胞与肿瘤细胞相互作用的肿瘤微环境。
3. 在IDH野生型胶质瘤患者中，单独的TNB与预后无关，但与CD8+ T细胞浸润相结合时具有预测价值。
4. 还记录了TMB低的肿瘤表达少量高免疫原性抗原，能引发强烈的细胞毒性T细胞反应的情况。

para

1. 最重要的是，在研究检查免疫检查点抑制剂（ICI）反应时，需要考虑抗原处理和呈递机制的改动，因为这样的改动可以改变局部免疫反应并赋予对ICIs的抵抗力。
2. 先前已有研究表明，黑色素瘤患者对ICIs的抵抗性与抗原呈递机制的缺陷有关，这通常是由B2M155的功能缺失突变引起的。
3. B2M在MHC I类抗原复合物的组装中具有关键作用，携带此类突变的癌细胞无法有效地将抗原呈递给细胞毒性T细胞156。
4. MSI-H CRCs中B2M失活突变的频率在所有癌症中最高157，这可能反映了这些肿瘤在发展过程中所经历的巨大免疫介导的选择压力43。
5. 有趣的是，据报道，B2M突变的MSI-H癌症与其B2M野生型对照相比，对ICIs的敏感性相似158。
6. 这一意外观察结果可能是由于研究队列规模小和回顾性设计所致，其他研究表明，此类突变甚至可能预示着更佳的预后159,160,161。
7. 另外，CD4+和γδ T细胞被提名为能够独立于B2M或HLA-I表达而排斥癌细胞的效应细胞162,163。
8. 除了抗原处理机制的缺陷外，例如，由于JAK1或JAK2的功能缺失突变导致的IFNγ信号受损，也可能影响对ICIs的反应性164。
9. 这些途径的改动不仅对解释TNB的效果至关重要，而且对受影响细胞的免疫生物学有深刻影响，并且在尝试理解TNB与ICI反应之间的关系时应予以考虑。

Future perspectives

para

1. 越来越多的证据支持TMB作为预测实体瘤患者对ICIs反应性的临床应用生物标志物。
2. 在多种TMB高水平的癌症类型中，可以看到从ICIs中获得更多临床益处，尽管支持TMB在特定癌症类型中的预测价值的证据较弱，且仅适用于部分实体。
3. 在一项包括近2000名接受ICIs治疗患者的回顾性分析中，将癌症类型分为在CD8+T细胞浸润与TNB之间存在显著正相关的实体（I类，包括子宫内膜癌、黑色素瘤、肺腺癌、宫颈癌、膀胱癌和结直肠癌）以及没有这种相关的实体（II类）。
4. 在II类癌症类型中，TMB的截断值10 mut/Mb未能预测对ICIs的反应，支持了需要对特定癌症类型中的TMB进一步评估以及优化截断值的观点。

para

1. 2020年，基于Keynote-158的数据，FDA批准了pembrolizumab用于治疗TMB高肿瘤（≥10 mut/Mb）的患者，不受肿瘤组织来源的限制，这些患者在一次或多次先前治疗后病情进展，且没有可用的满意替代治疗选项。
2. 迄今为止，尚未有在欧洲获得相应批准的报道。
3. 过去几年的临床试验数据支持TMB在CUP中的实用性，CUP是一种包含多种不同疾病异质群体的诊断，可能包括几种不同的癌症类型，通常治疗选择有限。
4. 在监管机构批准之外，例如在欧洲，当所有可用的批准疗法都已耗尽时，TMB可以作为晚期线下非标治疗的讨论依据。
5. 为了进一步扩大临床实用性，应在回顾性和前瞻性研究中进一步探讨TMB，以定义单一或特定疾病的截断值，并结合其他生物标志物。

para

1. TMB测量准确性的主要混杂因素包括使用小型NGS面板和某些肿瘤组织样本纯度的限制。
2. 使用较小的面板会导致TMB的测量不够精确，无法良好地区分出对ICIs有应答和没有应答的患者；因此，临床测量TMB的面板大小至少需要约1 Mb。
3. 值得注意的是，即使面板大小为1 Mb，随机不精确的水平仍将严重影响低至中等TMB（≤20 mut/Mb）的肿瘤TMB定量准确性。
4. 因此，为了提高临床表现，有必要研究更大的测序面板（≥2 Mb）或全外显子测序。
5. 分析低肿瘤纯度样本会降低检测体细胞变异的敏感性，进而导致TMB值降低。
6. 因此，检测高TMB患者的敏感性将降低。
7. 这种敏感性的丧失可能导致可能从ICIs中受益的患者未能使用这些药物，同时在比较TMB高肿瘤患者和TMB低肿瘤患者的临床试验中可能导致假阴性结果。
8. 肿瘤纯度≥60%是最佳的，而40–60%的肿瘤纯度会导致敏感性中等程度降低；然而，当低于40%时，这种降低尤其明显。
9. 总之，获得高肿瘤纯度的样本对于准确测量TMB至关重要，并且应通过仔细选择组织病理学样本以及肿瘤细胞富集策略来最大化。

para

1. TMB的复杂性以及对其测量，以及TMB修改和扩展的更大复杂性，需要广泛的测序和日益复杂的生物信息学工具的应用（例如，用于预测突变的免疫原性），这可能是临床实施的主要障碍。
2. 2023年一项关于欧洲临床实施生物分子技术的研究描述了全面测序方法的异质可用性，例如大型NGS面板、WES和WGS165。
3. 由于底层免疫生物学的固有复杂性，实现更好地区分ICI响应者和非响应者的目标将需要更准确的诊断工具。
4. 对更好生物标志物的需求以及开发和实施相关检测在临床实践中所需的不断增加的努力和专业知识，形成了一个需要解决的冲突领域。
5. 在接下来的几年里，NGS和生物信息学专业知识的可用性限制可能会通过持续的趋势如测序成本和微芯片价格的下降以及国家临床测序项目和/或分子诊断在专业中心的集中化166,167来缓解。

para

1. 除了TMB，PD-L1表达和MSI-H也被包括在某些患者群体的ICI批准中。
2. 然而，TMB和PD-L1在大多数癌症类型中并未显示出相关性，并且通常独立预测ICI的反应。
3. TMB还在MSS和MSI-H癌症患者中显示出预测价值，尽管在准确识别为MSI-H的肿瘤中，TMB的附加预测价值通常有限。
4. 因此，需要开发并验证旨在最佳结合TMB与其他生物标志物的策略。
5. 在针对可操作的分子改变并给予ICI是可行的情况下，需要解决治疗优先级甚至组合的问题。
6. 在肺腺癌患者中，大多数可操作的主要改变（包括EGFR突变和ALK、ROS或RET融合）具有有限的免疫原性（但KRASG12C突变除外）。
7. 对于这些患者，靶向治疗是首选的一线策略，尽管在后续线中使用ICI是一个有争议的话题。
8. 在其他癌症类型和其他靶向治疗中，当靶向治疗和ICI都指示使用时，临床数据通常不完整，需要进一步研究，以评估优先使用一种药物类别而非另一种，和/或结合以生物标志物如TMB为指导的针对可操作突变的疗法与ICI的可行性。

para

1. 对TMB的修改，无论是专注于特定突变子集还是结合特定类别突变的免疫原性（如cTMB、pTMB、eTMB、TNB和HLA校正的TMB），根据已发表研究的数据，都优于传统的TMB。
2. 然而，其中大多数研究只是在单一队列中评估了这些概念中的一个，从而阻碍了性能的直接比较。
3. 因此，在将这些概念应用于临床实践之前，还需要进一步验证。
4. 此类验证应包括在大型回顾性队列中对多个生物标志物进行头对头比较，正如已经在大型荟萃分析中所见，随后对临床上最相关的观察结果进行前瞻性验证。

Conclusions

1. 来自多个研究的数据支持TMB作为一种生物标志物，可以预测患者从ICIs中获得的益处，这一预测作用在不同癌症类型内部和之间都得到了验证。
2. 这些观察结果，加上TMB被纳入对pembrolizumab的非特定实体批准中，导致了TMB被引入到临床实践中。
3. 然而，仍然存在两个主要限制，需要在进一步的研究中解决：(1) TMB在10 mut/Mb截断点的预测效用只对某些癌症类型而不对所有癌症类型得到了验证。(2) 对于所有研究的癌症类型，TMB在区分对ICIs有反应的患者和没有反应的患者方面的能力是不完美的。
4. 在这种情况下，重要的是要记住，体细胞突变是触发细胞介导的抗肿瘤免疫反应这一长链因素中的第一个组成部分（图1）。
5. 对于这一过程，其他必不可少的因素包括抗原的处理和呈递、T细胞的启动以及细胞毒性T细胞对癌细胞的识别和杀伤。
6. 包括对抗原处理和呈递途径中功能丧失突变的存在的更全面和综合的评价，以及将这些影响各种过程的突变结合到一个签名中，将是克服TMB在预测对ICIs反应的有限敏感性和特异性的关键。