前期文章：
- 我们用两篇文章的篇幅大概讲了一遍质粒骨架及其各个要素的介绍：
解剖式学习一个质粒结构--update
质粒系列之什么是质粒 - 再谈了最传统的限制性克隆：
质粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面还夹杂的讲过一些piggybac、gateway、RMCE的一些内容：
基因编辑如何换药不换汤 -
慢病毒系列也有讲过两篇：
团队作案HEK293，史上最强搬砖细胞
不想再用慢病毒了，我还有什么别的选择吗？piggyBac transposon - 此外我们本还有一个CRISPR screening的专题，只有开头，未得完善：精准大海捞针--5. CRISPR screening专题
- 质粒系列之再谈无缝连接--Gibson assembly
正文
我们前面分别讲述了依赖于限制性内切酶的限制性克隆以及依赖于同源臂同源重组的Gibson assembly。前者的发现使得质粒改造变得成为可能，而后者的发明使得质粒构建变得如此快捷。我们在前文中提到限制性克隆的主要缺点是依赖特异性的酶切位点，然而限制性克隆中的Golden Gate克隆 （以下简称GG克隆）则并不逊色于Gibson assembly，堪称质粒改造王者，根本原因是GG克隆中所用到的IIS酶十分特殊。
限制性内切酶分类繁多，根据切割位点类型分为3类 ，切得老远老远的是I型；切割识别位点外25个bp左右的是III型；切割识别别位点及其附近的是II型。II型还有特定的亚型，包含IIS类，切割识别位点之外5-6个剪辑对的序列，简略比较图如下：
上图我将II型默认为我们常规用到的Ⅱ型酶（IIP型），由于II型酶还有各类亚型，为了方便后续学习，我们先简单了解一下II型酶家族都有哪些分类以及特征。
1. II型限制性内切酶家族
数量：II型限制性内切酶是日常分子生物学中最常见的酶，如基因克隆和DNA片段分析。目前已发现超过3500种II型酶，可识别超过350种DNA序列。通过对细菌和古细菌基因组的分析，已确定了数千种II型酶，但其特征仍未确定。
命名：限制性内切酶依据发现它们的微生物命名。例如，HindIII叫Hin d three是在流感嗜血杆菌（<u>H</u>aemophilus influenzae）<u>d</u>血清型中发现的第<u>3</u>种内切酶，由此可第二种和第一种则分明名为HindI、HindII。有时添加前缀r以区分限制性内切酶与它们细胞内的修饰酶。因此，R.HindIII专指限制性内切酶，M.HindIII专指修饰酶。当无歧义时，前缀r被省略。
常规亚分类： Type IIP, IIS, IIC, and IIT。II型酶分类有多达十几种，有机会的话我们可以详细讨论各种亚分类的不同结构以及为何会产生不同的切割结果（挖坑），想要自行学习的小伙伴可在文末查看我们推荐的文献。下面我们简单介绍一下常规使用的几种II酶亚类的区别。
大家一定好奇，II后面的字母是如何来的呢？
(1) IIP（<u>P</u>alindromic）：IIP型是最重要的亚型，占分子生物学中酶的90%以上 ，识别长度为4到8个碱基对的回文序列，切割位点也通常在该序列内 。大多数IIP型酶识别特异的DNA序列，每个位置只能有一个特定的碱基对(例如BglII: AGATCT)，但一些IIP型酶可识别简并（模糊）序列，其中可以有不同的碱基对。
(2) IIS（<u>S</u>hifted cleavage）：IIS型酶在识别序列之外的固定位置切割DNA。裂解点移（shift）到序列的一侧。IIS就是GG克隆使用到的酶类。
(3) IIC（<u>C</u>ombined）：同时具有内切酶和甲基转移酶活性。限制性内切酶大部分是由细菌和古菌产生的，其对宿主细胞具有潜在毒性，而对限制性内切酶的保护性解毒剂会以DNA甲基转移酶的形式产生。这种酶识别与限制性内切酶相同的序列，通过化学方法改变细胞自身DNA的每个位点，防止其被裂解。而这种DNA修饰包括甲基化，可通过形成空间位阻，阻止限制性内切酶与该位点结合。IIC型酶可以同时催化两种相互竞争的反应：酶切和甲基化。甲基转移酶反应普遍需要辅助因子s -腺苷蛋氨酸(SAM)。有些IIC型酶在裂解时也需要SAM，有些仅仅受到SAM的刺激，还有一些根本不需要SAM。如果存在SAM，甲基化会随着裂解而进行，从而阻止完全消化。IIC型酶在分子生物学中应用不多，所以我也并未用过这种酶。
(4) IIT（<u>T</u>wo different subunits or <u>T</u>wo different catalytic ）：异源二聚体限制性内切酶，包含两个不同的亚基，或具有两个不同的催化位点。
2. Golden Gate克隆特性
通过以上描述，我们得到的最直观信息是：（1）IIS型裂解识别序列外的序列；（2）IIS型为无痕连接。因而可以推测GG克隆的特性：
（1）切割识别序列外序列， 则说明切割位点并不特异，任意序列只要在这附近有特异性的IIS型酶识别位点即可，这就提供了酶切的无限可能！
（2）无痕连接：切割后若为自连，则IIS酶会不断酶切自连位置，因此自连产物几乎不太可能会被转化进感受态细胞（只有酶切不完全的情况下，会有原始质粒被转入感受态的可能）；切割后若连接成功则丢失酶切位点，因而只要连接，即是成功。基于这个特性，酶切和连接可以在同一试管内完成，无需酶切回收片段后再连接，该效率堪比Gibson assembly。
（3）速度快、效率高：由于切割和连接可在同一管内完成且效率几近100%，因此反应在半小时内即可完成。
（4）多片段可同时组装，只要插入片段两端酶切位点设计得当，即可同时连接多达10个以上片段。
Golden Gate克隆示意图
下图描述了两种常用的插入片段制备办法，无论是酶切还是PCR，其根本还是要产生互补的粘性末端，因此只要粘性末端设计得当，可同时插入多种片段。具体的方法可参考2020年新发表的文章：Synthetic DNA Assembly Using Golden Gate Cloning and the Hierarchical Modular Cloning Pipeline，具体信息在文末给出。该文描述了5种basic protocol，并给出了案例分析以及实验条件，由于本文篇幅有限，则不再展开该文，但非常值得一读。
3. 案例学习
在我们前面CRISPR-Csa9实验记录系列推文中，将sgRNA插入到Cas9质粒这个步骤使用的就是GG克隆的方法。接下来我们仍以这个克隆为例，分析实验设计方案以及实验条件调整用意。
3.1 准备gRNA oligo片段，一般使用梯度退火即可达到互补配对的效果
原设计汇总sgRNA的获取是通过PCR扩增的，PCR产生的线状DNA产物需要通过T4 PNK进行磷酸化，以提高后续连接效率。而我们的方案中由于使用的载体是 pSpCas9(BB)-2A-GFP，载体经过改进，BbsI两位点在U6启动子后面，gRNA scaffold前面，因此只需要将那20 nt长度的gRNA序列插入即可。而这gRNA序列是公司合成的，无须再进行磷酸化。
3.2 使用Golden Gate克隆将gRNA片段插入
经过调整，将T7连接酶改为T4连接酶，而T4连接酶的缓冲液已经带有DTT、ATP等成分，无须另外添加。虽然我们总是说GG克隆可以在30分钟内完成反应，但在这个实验中我们使用的是37℃与25℃交替反应6个循环，即为酶切-连接进行6个循环。在酶切-连接6个循环结束后，添加一个37℃ 30 min的步骤用于酶切未完全酶切的载体质粒，以减少感受态转化后的自连克隆。同时添加65℃ 5 min步骤用于失活BbsI和T4连接酶，以免对感受态细胞造成伤害。
4. Golden Gate应用
4.1 合成生物学
合成生物学家已经开发出一种模块化克隆策略MoClo，它使用IIS型限制性内切酶BsaI和BpiI/BbsI一次有效地组装多达6个DNA片段。这种方法利用IIS型酶在识别位点外切割的能力，并允许具有兼容悬端的DNA片段被有效组装。
通过设计出独特的酶识别位点，使DNA模块的侧翼呈反向方向，这样多个DNA组分就可以在一个单一反应中定向组装，而在两者之间只保留一个确定的4bp融合位点。
MoClo系统由三组克隆载体（Level 0, Level 1, Level 2）组成，可以在三个连续的组装步骤中使用。
（1）在开始之前，将包含基本部分（启动子、utr、编码序列、终止子等）的DNA片段插入到单个的level 0质粒中；
（2）在第一步组装中，兼容的level 0被定向组装成level，创建一个转录单元（例如:启动子、5 UTR、编码区域和终止子）。
（3）接下来，多达6个level 1模块可以类似地组装成level 2，从而形成一个基因结构。
在最后的组装步骤中结合多个2级载体可以创建更复杂的结构。
4.2 基因工程
就如我们上面举的案例一样，在CRISPR-Cas9基因编辑技术中，我们用到GG克隆将gRNA有效的插入到Cas9质粒中。此外基于GG克隆强大的DNA片段组装能力，可使用GG克隆高效组装TALEN以及TAL序列，从而参与基因编辑工作。具体信息可以查看我们文末提到的参考资料。其实只要是用到质粒改造的领域，GG克隆都有可能参与。因此无所谓它到底应用在哪儿了。
5. 结语
GG克隆虽然有效率高、速度快且操作简单的优点。从多组分组装来说，Gibson assembly仍相当具有竞争力。同传统限制性克隆一样，插入片段中如若含相同的IIS型酶切位点，会造成额外的酶切，因此IIS酶的酶切只能存在对的位置。而如果插入片段中含有同样的识别位点，可通过PCR对该片段进行点突变沉默。而如果插入片段的相同IIS酶切位点太多无法完成突变时，可考虑使用Gateway克隆。我们之后也会单独写一篇Gateway克隆（继续挖坑）。
对于非合成生物学、基因工程领域的我们，平时用到GG克隆的情况不多。首先IIS型酶种类并不算特别多，目前NEB上约有50种；其次与传统限制性克隆一样，GG克隆仍然依赖酶切识别位点；载体或者插入片段同时拥有合适酶切位点的情况不多见，还需要通过PCR对插入片段额外引入粘性末端，这个操作过程与Gibson assembly差不多一致，因此大多数情况大家还是会选择Gibson assembly。然而Gibson assembly依赖可同源重组的粘性末端，当载体中具有相似同源片段时会有错配的可能，此时可考虑使用GG克隆。
今天就到此为止，谢谢大家。
