1.背景
目标区域测序(Target region sequencing)是通过定制感兴趣的基因组区域的探针,与基因组DNA进行杂交,将目标区域DNA富集后进行高通量测序的研究策略。通过对大量样本的目标区域研究,有助于发现和验证疾病相关候选基因或相关位点,在临床诊断和药物开发方面有着巨大的应用潜力。
2.技术优势
高密度信息
针对目的基因组区域进行遗传变异位点检测高准确性
对特定区域深入研究,得到更深的覆盖度和更高的数据准确性,提高了对稀有变异的检测能力高性价比
更经济有效,更高通量,适合大样本量研究更快捷
缩短研究周期,加快文章发表与加速临床应用
3.取样方式
通过某种方法有选择性的分离或者富集基因组的特定片段。
PCR:通量小,成本高昂,稳定性差
杂交法:依据核酸分子碱基互补杂交原理发展的,根据杂交时状态的不同分为固相杂交法和液相杂交法。
4.杂交捕获
杂交捕获的原理是人为设计探针(DNA或者RNA形式),探针可以和目标区段部分或者全部互补。将样本和探针混合,探针会将目标区段捕获,未设计探针的区段会被洗脱丢弃,之后通过变性(一般是调节PH值到碱性)将探针和捕获区段分开,被捕获的片段即可进行二代测序文库构建。
根据探针的状态不同,杂交捕获又因为杂交状况不同分为固相杂交和液相杂交。
4.1固相捕获
(1)选定目标DNA区域,在修饰了的玻璃片基上原位合成一系列与目标区域互补的探针。
(2)在芯片上进行DNA与探针的杂交反应。
(3)将与探针杂交的DNA洗脱下来,用于后序的测序工作。
4.2液相捕获
(1)在溶液中,目标DNA片段和已带有生物素标记探针直接杂交,然后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的微珠上。洗去非目标DNA,洗脱后,富集的DNA用于测序。
(2)杂交效率更高
(3)易于操作,时间短,便于自动化操作
4.3 Aligent测序平台
4.4NimbleGen测序平台
4.5illumina 测序平台
第一步,先把基因组DNA进行超声打碎,建成DNA文库。
第二步,把建好的文库和探针库进行杂交。杂交过程中,通过核酸序列的互补结合的原理,探针会和目标DNA片段进行结合。
第三步,再用结合了链霉亲和素的磁珠,与这个杂交混合液呐进行混合。因为链霉亲合素是会和生物素牢固结合的。这样,就把我们要捕获的目标片段,通过探针,间接地结合到了磁珠上。
第四步,通过磁铁把这些磁珠给吸附下来。
参考文献:
Michael J Clark. et al. Performance comparison of exome DNA sequencing
technologies. Nature biotechnology 29, 908–916 (2011)
文献地址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4127531/
Mamanova L, Coffey AJ, Scott CE, et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.[J]. MLO: medical laboratory observer, 2012, 44(6):26.
文献地址:https://sci-hub.tw/10.1038/nmeth.1419
5.实验流程
6.应用领域
目标区域捕获适用于疾病的大样本量分析包括帕金森、智力障碍、扩张型心肌病、乳腺癌等多种疾病的研究。
针对临床应用,适用于单基因遗传病检测、癌症易感基因检测、心脑血管疾病基因检测、用药指导基因检测等。
7.常见问题
关于重测序、外显子测序与目标区域捕获差别,只是测序对象大小不同,重测序是针对整个基因组,外显子是针对外显子区域,而目标区域捕获是针对我想要研究的那一段序列。分析流程差不多。
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