常用DNA操作技术

核酸电泳

根据核酸分子大小选择琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作支持物制胶板→点样→电泳→染色→照相或扫描用溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色的核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA条带

1、限制酶切图谱（DNA物理图谱）

用限制酶消化DNA分子后经凝胶电泳分离，根据电泳图谱分析确定各种酶切位点在DNA上的相对位置，即可以绘制出一幅完整的限制酶切点图谱。酶切作图的时候，先选择某种对DNA分子只有一个切点的酶进行切割，并以此切点为起点，然后进行适当组合的双酶切和多酶切，根据各种酶切所得DNA片段的大小及变化，即可以推测并确定各个位点的相对位置。对于重组DNA分子，可用识别序列为4个碱基的限制酶组合进行切割，经电泳测量片段大小做出精细结构图。

获得限制性图谱的作用：进一步证实转化体中含有重组DNA 分子以及外源DNA 片段插入的特定位置。

2、RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism ）

原理：RFLP 是了解基因细微结构及其变化的一种方法。如果两 个DNA 分子完整相同，用同种限制性内切酶在相同的条件下消化，所得的限制性内切酶谱相同。如果两个DNA 分子基本相同，只在一处或几处发生某种变异，就是很小的差异，消化后两DNA 分子的限制性酶谱的条带方式不同，即产生多态性。对这些条带分析可获得两种DNA 分子结构差异的信息。

RFLP 也可用来研究基因突变和基因转化：例如某限制酶对一DNA 片段有A 、B 、C 三个切点，完整消化后电泳出现四条带，若该片段中有外源基因插入，插入部位没有影响酶切位点，并且插入的片段中也无该限制酶的切点，那么谱带数与原来相同，但有的条带的迁移率将出现差异，即产生多态性；若插入位置正好在酶切位点上，则条带减为三条，不出现迁移率的变化；若插入的外源基因内有一个该限制酶的切点，且没有影响原来酶切位点，则条带增为五条，这三种情况都发生了多态性。若未发生转化，则条带数目及迁移率与原来相同，无多态性出现。

3、SNP（single nucleotide polymorphism）

SNP是在基因组水平上由于单个核苷酸的变异而产生的一种DNA序列多态性。这种单核苷酸变异包括单碱基的转换和颠换。

变性梯度凝胶电泳检测SNP：异源DNA双链与同源DNA双链由于熔解温度Tm值不同，从而在分子稳定性或单链构象上也不会完全相同，据此，利用变性剂的浓度梯度凝胶电泳来进行分离检测。分别具有一种SNP等位基因型的两种DNA分子之间即使只有一个碱基对的差异，也会在不同时间发生部分解链，从而分离成两条带

4、凝胶阻滞试验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）

是利用电泳分析蛋白质与DNA相互作用的技术

原理：蛋白质与DNA结合后分子质量将增加，在电泳中移动的速率减小，没有结合蛋白的DNA片段迁移速率大。利用这一原理可分离纯化细胞提取物中特定DNA结合蛋白

核酸序列分析

测序策略：测定含有靶DNA随机片段的序列，利用计算机排列每个序列在靶DNA中的位置。

1、双脱氧链终止法

1977年由Sanger发明的用来测定单链DNA的序列

原理：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3’-末端，从而终止其延伸反应。电泳分离反应产物，读出基因的序列。

在DNA测序反应中，加入模板DNA、引物、DNA聚合酶（常用Klenow大片段，无5’→3’外切酶活性）、dNTP，在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、G、C或T的位置上，电泳分离读序。

2、化学修饰法

利用对DNA化学降解测序。通过对末端标记的DNA片段在4组独立的化学反应中分别进行部分降解，其中每一组反应特异地针对某种或某一类碱基。因此生成4组放射性标记的分子。每组混合物中均含有从标记端到降解位点长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。反应后进行电泳分离放射自显影来检测末端标记的分子。

3、DNA序列分析自动化

用荧光剂标记DNA引物（或dNTP），被标记的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用计算机检测(在凝胶装置的底部有由激光源和探测器组成的检测系统)。

4、焦磷酸测序技术

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是依靠生物发光进行DNA序列分析的。在4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。整个测序反应都是批量进行的，不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳，具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点，以及高通量分析的要求。

Pyrosequencing技术是由在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。

在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。在ATP硫酸化酶作用下，生成的PPi可与APS（腺苷-5’-硫酸）结合形成ATP，在荧光素酶催化下，生成的ATP又可与荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATPApyrase（三磷酸腺苷双磷酸酶）作用下降解。加入另一种dNTP，重复进行反应，根据峰值图即可读取DNA序列信息。

5、Solexa技术

Solexa技术由两位剑桥大学的化学家创立，利用 “DNA簇” 和“可逆性末端终结”技术，达成自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。Illumina公司2007年收购 Solexa推出Genome Analyzer（基因组分析系统）。Genome Analyzer具有高准确性，高通量，高灵敏度和低运行成本等优势。可同时完成基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。将基因组DNA打成几百个bp（或更短）的片段，在片段两端加上接头(adapter)。将单链DNA片段与芯片结合，芯片表面连接有一层单链引物（Primer），DNA片段通过芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上，引物扩增使得单链DNA成为双链。该双链变性后成为单链，其一端“固定”在芯片上，另外一端（5’或3’）随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”（bridge）。这样的反应在上千万DNA单分子上发生，形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增反应。反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆“DNA簇” 。“DNA簇”被用做测序模板在Genome Analyzer 综合分析仪上进行测序。利用“可逆性末端终结反应”进行测序。4种碱基分别标记4种不同荧光，每个碱基末端被封闭，单次反应只能加入一个碱基，通过激光检测每次加入的碱基后，标记和保护基团被脱去进入下一轮合成反应，如此反复，得出碱基序列。

聚合酶链式反应及应用

1985年Mullis等发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)。在试管中给DNA合成提供：模板DNA，引物，DNA聚合酶，缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成

Taq酶的特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%。②在热变性时不会被钝化。③可提高扩增片段特异性和扩增效率，增加扩增长度(2.0kb)。Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20~85℃，高于90℃时合成很难进行

PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度

设计引物应遵循的原则：

①引物长度常为20bp左右。

②引物扩增跨度200～500bp。

③引物G+C含量以40～60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构以及两条引物间互补。

⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基应严格配对。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

【一般1Kb以内的DNA片段延伸1min。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多】

PCR产物是否为特异性扩增，必须进行分析鉴定才能得出结论：

1）凝胶电泳分析：PCR产物经电泳分离，产物片段的大小应符合预计的大小

2）酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶切位点，酶切后电泳分离，应获得符合理论的片段

3）分子杂交：检测PCR产物的特异性

4）核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法

基因组文库的构建

基因组文库（genomic library）是将某种生物细胞的整个基因组DNA切成适当长度的片段，连接在载体上，转化到宿主细胞中而构建的克隆总体。理论上这些重组子应包含有整个基因组DNA序列。构建基因文库的目的主要是为了直接从基因组中分离（钓出）目的基因。从概率原则来看，只有当文库中重组子总数达到某一数值时，才能包含基因组中的所有基因。构建完整基因组文库所需的重组子数目，主要取决于基因组的大小和目的基因片段的大小两参数。

对于某一特定基因组，构建成其DNA文库所需的重组子数目基本上取决于所用载体的容量大小。构建高等生物基因组DNA文库时，通常采用噬菌体载体，其克隆容量大（约为24kb），可减轻克隆和筛选大量重组子的工作量。

应用噬菌体载体构建基因组文库的程序：

①用适当的限制性内切酶消化基因组DNA ，以得到约20kb 的片段；

②用限制性内切酶切割载体DNA ， 使其形成与 外源DNA 相匹配的粘性未端；

③用适当的方法除去噬菌体裂解生长非必需的内部片段；

④噬菌体载体臂与外源DNA片段连接；

⑤利用体外包装系统进行噬菌体的组装；

⑥重组噬菌体侵染E. coli ，每一克隆中含有外源DNA的一种片段，全部克隆构成一个基因文库。

cDNA文库的构建：

cDNA文库是一生物的总mRNA为模板，用逆转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到载体上，转化宿主细胞后构建的基因文库为cDNA文库。如果用某种特异的mRNA（不是总的mRNA），由此建成的克隆则称为该种特异基因的cDNA克隆。此外cDNA文库比基因组文库要小（一般相差10~100倍），在基因的克隆和筛选方向也具有较大的优势

构建成cDNA文库的基本程序：

①mRNA 的提取和纯化。

②合成cDNA 第一链。

③将mRNA-cDNA 杂交分子转变为双链cDNA 分子。

④将双链cDNA 重组到噬菌体载体或质粒载体上。

⑤将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。

分子杂交技术

可以鉴定核酸分子之间的同源性，是分子克隆技术的重要组成部分

探针

探针是一段标记核酸序列，长度在15个核苷酸~1kb，也可以是完整或部分基因。探针可与靶序列互补形成杂交双链，通过检测杂交链信号即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别。探针可以是克隆的，也可以是合成的。用PCR扩增产物可制备探针。也可用提纯的质粒进行标记制备探针。

1、探针的种类及应用

克隆探针：特异性强，复杂度高，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列的少，杂交信号强（掺入的可检测标记基团多）、稳定。用于未知序列的测序和绘制酶切图谱。

合成寡核苷酸探针：复杂度低、杂交时间短（分子量小）可大量合成，可用酶学和化学法修饰，一般长为18～50nt。可检测点突变，探测cDNA文库，研究蛋白质的编码基因，传染病和遗传病的诊断。

cDNA探针：由mRNA反转录而来，无内含子。用于分析内源基因缺陷、外源基因和基因表达的检测。基因组探针：来源于基因文库，用于筛选所需的含特定基因的重组体，以便次级克隆和测序。内含子序列可用于区别同源性高的基因。

RNA探针：直接分离的mRNA、rRNA、病毒RNA或体外转录的RNA。用于反向杂交检测基因的转录状态；检测mRNA的表达水平；rRNA探针用细菌分类。

2、探针标记方法

缺口平移、随机引物、末端加尾、末端标记、逆转录掺入、体外转录、PCR标记等

末端标记：如T4激酶（5’）或脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）(3’)端标记

放射性同位素标记：32 P和 35 S。 32 P能量高信号强。放射性同位素有辐射危害和半衰期限制( 32 P半衰期14.3天，35 S为87.1天， 125 I为60天。 3 H为12.3年，但释放β射线的能量太低，只能用于组织原位杂交)。

非放射性标记物：荧光物质，半抗原如地高辛、生物素，酶类如辣根过氧化物酶(HRP)、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶(AKP)等。

生物素标记：将生物素（Biotin）连接在核酸探针上，利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理，分子杂交后用亲和素（Avidin）或链霉亲和素（Streptavidin）进行检测。

酶促生物素标记技术：生物素与dUTP中尿嘧啶的5位C相连，在聚合酶作用参入DNA。

光促生物素标记技术：用光敏生物素（Photobiotin）标记探针。光敏生物素主要有乙酸盐和补骨脂素生物素，其结构由三部分组成：光敏基团、连结臂和生物素。强光下光敏基团可与核酸中的碱基相结合。可用于单链或双链核酸（DNA或RNA）标记。

地高辛（Digoxigonin）标记：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连。

荧光素标记：荧光物质异硫氰酸荧光素（黄绿色）、试卤灵（红色）和羟基香豆素（兰色）等。用荧光素标记核酸；用荧光素标记抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。

光敏生物素标记核酸方法简单，但标记效率不高，每100～150nt才能标记一个生物素，对于短的探针不宜使用。

核酸分子杂交

分子杂交(hybridization)是应用核酸分子的变性和复性的性质，使两条来源不同的具有一定同源性（即具有碱基互补关系）的DNA单链分子或DNA单链分子与RNA分子经退火形成双链DNA分子或DNA-RNA异质双链分子(heteroduplex)的过程。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。杂交首先透过加热或碱处理使双螺旋解开成为单链，然后在一定条件下使互补核酸链实现复性。

1、杂交分类

①溶液杂交（solution hybridization）：将不同来源的DNA变性后在溶液中进行杂交。

②滤膜杂交（filter hybridization）：硝酸纤维素滤膜可吸附单链DNA或RNA，将变性的DNA或RNA吸附到膜上进行杂交。印迹法（blotting）是将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

2、杂交方法及应用

① Southern blotting

将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针（DNA/DNA杂交）进行检测的方法。DNA样品经限制性内切酶消化后，DNA片段在电泳凝胶中分离。凝胶经变性处理（加碱性缓冲液），使其中的DNA双链分子变性成单链，利用毛细管作用原理将凝胶中的单链DNA分子转移并固定到固相支持物表面上（硝酸纤维素膜或尼龙膜），此时DNA片段还保留着在凝胶中的分布图式，电泳印迹可更快速有效地进行转移。用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可使DNA离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流下，洗脱出凝胶中的DNA，使其沉积在滤膜上。用探针与膜上的DNA片段杂交，根据与probe有同源性的DNA片段在膜上的位置可通过放射自显影而得知。

②Northern blotting

mRNA样品经电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜（或叠氮化活性滤纸，尼龙膜）上，与放射性标记的DNA探针进行杂交，经放射自显影，即可检测特异性mRNA分子在样品中存在与否，及其长度大小和量的多少。与Southern分子杂交技术不同之处在于Northern分子杂交技术用于检测特异性mRNA的存在，转膜不需变性。用于研究特异性mRNA分子在细胞处于不同条件下发生量和质的变化，或不同组织器官中基因表达的差异。

③Western blotting

蛋白质印迹技术是1975年Southern建立了Southern印迹法后，人们用类似的方法对蛋白质进行印迹分析，称为Western印迹法。蛋白质经单向电泳后分离后被转移到硝酸纤维滤膜上，然后用放射性或酶标记的特异抗体来检测相应抗原的存在。将电泳后分离的蛋白质通过毛细管印迹法或电泳印迹法从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上。转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进一步检测。印迹先用蛋白溶液（如10％的BSA）封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，后用目的蛋白质的抗血清（一抗）处理，印迹中只有目的蛋白质与一抗结合，清洗去除未结合的一抗后。再用标记的二抗与一抗结合，可指示一抗的位置，即是目的蛋白质的位置。

④Eastern blotting

Eastern blotting是Western blotting的变形，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

⑤dot blotting

斑点杂交是将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。

⑥In Situ Hybridization（原位杂交）

原位杂交是将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。通过原位杂交确定杂交体在样本中的原来位置。包括 原位菌落（或噬菌斑）杂交、Northern原位杂交和Southern原位杂交等三种意义上的原位杂交。

原位杂交以标记的外源基因为探针，在适宜的条件下，探针与固定在玻片上的细胞内变性染色体上互补序列形成稳定的杂交体，然后根据探针标记的性质进行检测，放射性同位素标记的探针用自显影检测。酶标记探针通过显色反应检测

程序：材料预处理、细胞固定、细胞的Rnase（或Dnase，Northern杂交）酶解（降解RNA，减少非特异性杂交）、染色体变性（NaOH）、杂交、检出5个程序。

特点：原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究，不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高。能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。原位杂交最大的优点是使用上的普遍性，因为这种方法不要求插入序列的表达，只要有适当的核酸杂交探针，任何DNA序列均可用此法检测。

组织细胞的原位杂交：

Northern原位杂交

在细胞、组织切片上直接进行分子杂交，通过检测细胞内特异mRNA的存在与否来了解哪些细胞中有特异基因的表达。

Southern原位杂交

通过杂交来确定外源基因在染色体上的位置。它是基于处于细胞分裂过程中的染色体可用光学显微镜观察到，并可通过染色体的形状以及经不同染色后形成的条带分布来对各染色体进行鉴别和分析。

⑦PCR-Southern杂交

先对被检测的材料进行外源基因的PCR扩增，然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带进行杂交。

Southern杂交的灵敏度很高，可以检测出1pg的单考贝外源基因，但实际上往往达不到此检出量，主要是因为Southern对样品DNA的纯度要求较高，未经纯化的样品杂交效果不理想，另外Southern杂交需要的样品量较大（5~15gDNA），转化材料少的情况下不能及时检测。利用PCR-Southern杂交可以弥补这两点。

⑧Southwestern blotting

DNA与蛋白质的体外吸附技术（Southwestern blotting）结合了Western印迹与southern印迹两种实验方法的特点而设计的一种检测序列特异性DNA结合蛋白的实验方法，用以研究DNA和蛋白质的相互作用，将PAGE后的蛋白质分子，通过电泳转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后用同位素标记的DNA探针进行吸附，这样与DNA有亲和作用的蛋白质条带便可显示出放射自显影条带。

分子克隆技术

基因的大规模克隆

随着动植物基因组全序列测定，识别的开放读码框大量增加，为了了解基因的功能，需要把不同的开放读码框连入各种载体，进行蛋白表达、抗体制备、寄主细胞或植物转化、表型分析、细胞内定位以及目的蛋白与其他分子的相互作用等后续研究。

Gateway基因大规模克隆法利用噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的开放读码框提供了保障。

Gateway克隆技术包括TOPO反应和LR反应：

TOPO反应：将目的基因PCR产物连入Entry载体，载体上的CCCTT被拓扑异构酶识别切割，酶通过其Tyr 274与切口处的磷酸基共价相连。加入PCR产物后，形成的3’突出端GTGG，攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火，切去GTGG后使PCR产物连入Entry载体。

LR反应：用于将目的片段从Entry载体中重组人表达载体。

Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和anR2位点，在重组蛋白的作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2，将目的基因转移到表达载体中。

基因敲除(gene knockout)

基因敲除是通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。胚胎干细胞（embryonic stem cells， ES细胞）可在体外被无限期地培养，并分化成多种类型的细胞。

1、完全基因敲除（利用同源重组进行敲除）

程序：打靶载体的构建→打靶载体导入ES细胞（重组置换）→基因敲除ES细胞注射入胚泡→胚泡植入假孕小鼠的子宫中→嵌合体的杂交育种

原理：构建含有一段与靶基因同源序列（10～15kb）的载体，该序列的一个外显子插有抗新霉素基因neo r为正选择标志，在此序列3’端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因为负选择，HSV-tk基因由邻近的neo r 基因启动子调节。

2、条件性基因剔除

对于重要功能基因进行完全基因敲除会导致胚胎死亡，影响基因功能研究。因此常用Cre/LoxP和FLP/FRT系统进行组织特异性敲除。根据实验需要，设计在不同发育时期、不同的空间任意敲除任何一个靶基因。

①构建条件型基因敲除打靶载体，将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入同向LoxP位点。

②需要消除靶基因活性时，与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交，Cre可把两个LoxP位点间的DNA片段切除，导致靶基因失活。也可用Cre表达质粒转染中靶ES细胞，通过重组将两个LoxP位点间序列删除（包括neo基因）。

农杆菌介导基因转移（利用随机插入突变敲除）

Ti质粒(tumor-in-ducing plasmid)转移DNA (transfer DNA, T-DNA)

植物基因敲除株系筛选：T-DNA插入失活进行植物基因敲除。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的序列标签整合到基因组DNA上，如果它插入到目的基因内部或附近，就会影响其表达，从而使该基因“失活”。

利用PCR可以筛选出基因敲除株系，T-DNA无专一整合位点

基因的定点诱变

定点突变（site-directed mutagenesis）是通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等

方法分类

1、寡核苷酸介导的DNA突变：含错配的寡核苷酸与目的序列退火、聚合酶延伸及连接酶连接、转化、分离RFDNA。

2、重叠延伸介导的定点突变：诱变引物扩增出两种靶片断→退火→末端补平→扩增

3、大引物诱变法：正反（突变）向突变引物扩增→产生大突变引物→与野生型DNA和正向引物混合→退火→PCR

酵母单杂交法

酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白质间的相互作用（酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用）

原理：将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter，Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(activation domain，AD)融合表达载体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件结合，而激活Pmin启动子使报告基因表达。

应用：酵母单杂交体系主要用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因，验证反式转录调控因子的DNA结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列

酵母双杂交体系

酵母双杂交体系（Two-hybrid system）是用于分离与已知靶蛋白质相互作用基因的方法。

细胞起始基因转录需要有转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的，这些因子一般由2个或2个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域(DNA binding domain，BD)和转录激活结构域(AD)是转录激活因子发挥功能所必需的。不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的GAL4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍可结合到Gal4结合位点并激活转录。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。

主要有二类载体：含BD的载体和含AD的载体。

常用BD基因有：GAL4(1-147)、LexA (E. coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。

常用的AD基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株，报道株是经改造的含报道基因（如lacZ）的重组质粒的宿主细胞。因此，如果使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成融合蛋白的形式表达并定位于核中，X与Y间的相互作用就可将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列（upstream activation sequence，UAS）结合，发挥激活转录功能使受调控的报告基因表达，双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研究。

基因表达研究技术

SAGE(serial analysis of gene express)

一段来自于任一转录本特定区域的“标签”（Tag），即长度仅9-14bp的短核苷酸序列，就已包含足够的信息来对应于特定的转录本。如果将短片段标签相互连接形成长的DNA分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理，这样就可对数以千计的mRNA进行批量分析。各转录本的表达水平可以用特定标签被测得的次数进行定量。

原理和操作步骤

①以biotin-oligo dT为引物将mRNA反转录合成双链cDNA，经锚定酶（Anchoring Enzyme, AE）酶切后收集cDNA的3’端部分。锚定酶通常为识别4碱基位点的III类限制性内切酶

②将收集的3’端cDNA等分为两部分，分别同接头A、B相连接。每一种接头的结构都由PCR扩增引物A或B的序列、标签酶识别位点和锚定酶识别位点三部分组成（标签酶（Tagging Enzyme, TE）是一种IIS类限制性内切酶）

③连接产物以标签酶酶切后用Klenow酶补平5’突出端，得到两组分别带有接头A、B的短cDNA片段（约50bp）。混合并连接两组短cDNA片段，形成一个约100bp的双标签体（ditag）群，并以引物A和B对其进PCR扩增。

④用锚定酶切割扩增产物，分离纯化去除接头后的双标签体（约26bp），并使之相互连接成为大片段的连接体，克隆至质粒载体内形成一个SAGE文库以备集中测序。

⑤对测序得到的标签数据进行分析处理。在所测得序列中的每个双标签体之间由锚定酶序列相间隔，一般一个测序反应的结果可得到约20个双标签体，亦即包含了约40个转录本的信息。

RNA干涉

双链RNA（dsRNA）对基因表达的阻断作用被称为RNA干预（RNA interference， RNAi）。双链RNA（dsRNA）经酶切后会形成很多小片段，siRNA(short interference RNA)和miRNA (microRNA)。siRNA一旦与mRNA中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。

作用机理：

动植物和人体的病原体中有一些是RNA病毒。当病毒入侵，转座子(TE)转录或基因组中反向重复序列转录时，细胞中的RNA可结合成分子间dsRNA，也可以通过RNA链自身回折形成分子内dsRNA。dsRNA进入细胞后可在Dicer酶（具有RNase Ⅲ活性）作用下被裂解成21～25nt的双链siRNA，也可在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶，RNA-directed RNA polymerase）作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA和miRNA。siRNA的双链解开形成的单链与RISC（RNA诱导的沉默复合体）结合，再参与同siRNA互补的mRNA结合而使mRNA裂解。同时，siRNA可作为特殊的引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21~23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。

基因芯片

原理

生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。核酸杂交技术是基因芯片应用的基础（将一系列的核酸片段固定在芯片载体上作为固相靶片段，待测的核酸片段人工标记上不同的荧光、或同位素等作为探针，一定条件下两者杂交，根据杂交后不同的信号即可获得靶片段的信息，进行计算机分析）

生物芯片分为三大类：基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室

基因芯片技术主要包括：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析

基因芯片的制备

生物芯片是以一块有多聚赖氨酸包被的硅片上或玻璃片为载体，采用原位合成和微矩阵（直接点样）的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。

基因芯片样品制备

以一张表达谱芯片需要3μg mRNA计算，需要不同的组织约为0.2~1.5g。

杂交

待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及用荧光标记，以提高检测的灵敏度。杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。

信号检测和结果分析

杂交反应后芯片上各反应点的荧光位置、荧光强弱可用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得。样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素，但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多，因此，通过对信号强度的分析，就可以区分正确与错误的配对。

基因芯片的应用

1、基因表达分析

基因芯片具有高度的敏感性和特异性，可监测细胞中mRNA拷贝的转录情况。分析基因表达时空特征、基因差异表达检测、发现新基因以及大规模DNA测序。

基因芯片杂交测序（sequencing by hybridization, SBH）：任何线状的单链DNA或RNA均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸（亚序列，subsequence）。样品扩增并经标记后与片基上所有序列进行杂交反应，就会出现特定的杂交图谱，有杂交信号部位的寡核苷酸片段与待测样品序列是互补的。（首先用生物素标记经扩增的靶序列或样品，然后再与芯片上的大量探针进行杂交。用链霉亲和素偶联的荧光素。具有错配的杂交信号要比正常配对的杂交信号弱许多，借此可将二者区分开）。最后分析产生杂交信号的寡核苷酸序列的重叠情况进而 由计算机推导出样品的核酸序列。

2、基因型、基因突变和多态性分析

在同物种不同种群和个体之间，有多种不同的基因型，这种不同往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较，就可以得出基因与性状的关系。但由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的，利用基因芯片技术可以同时反应数千甚至更多个基因的特性，就可分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。

3、疾病的诊断与治疗

基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析。基因芯片技术已被应用于遗传病相关基因的定位、肿瘤诊断、感染性疾病的诊断、耐药菌株和药敏检测等方面的研究。

4、药物研究中的应用

寻找新药目标之一是应用芯片可以在基因水平上寻找药物靶标。从而找到“导向药物”。基因芯片也被用于寻找蛋白激酶抑制物、细菌或肿瘤组织的耐药性研究、药物处理细胞后基因的表达情况、药物毒性评价等方面。