作者，Evil Genius
阳了个阳，出门在外，注意保护自己。
本篇参考文章Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer, 2022年11月发表于nature，在文章单细胞空间宏基因组揭秘微生物群对癌症空间和细胞异质性的作用中已经进行了导读，但是很多细节问题仍然需要探讨。
文章的研究核心：
微生物对肿瘤生长发育侵袭的影响
研究的样本：
oral squamous cell carcinoma (OSCC) and colorectal cancer (CRC)
技术：
10x Visium spatial transcriptomics
GeoMx digital spatial profiling
single-cell RNA-sequencing method
第一部分：检测微生物的空间分布
由此可以获得肿瘤组织空间微生物分布信息：
当然微生物的研究也是一项很深的课题，高通量16s的检测也是科服行业的一个分支。有很多说法表明我们人类有两套基因组，一套是我们自身的DNA，另外一套就是与我们共存的微生物基因组，如果将来新冠与我们共存，我很怀疑病毒的遗传信息会整合到我们人类的基因组里面，当然，这个只是我的臆想。
第一部分：口腔微生物群组成：
根据人类口腔微生物组数据库（HOMD），口腔中大约有700种微生物。口腔中的共生菌包括厚壁菌门、变形杆菌门、拟杆菌门、放线杆菌门、梭杆菌门、奈瑟菌门和TM7。口腔有几种不同的微生物环境，包括：颊粘膜、龈下菌斑、龈上菌斑、角化牙龈、硬腭、唾液、扁桃体、舌头和喉咙。 口腔和腭粘膜的多样性低于其他口腔栖息地。
第二部分：肠道微生物组构成
- 肠道是人体内最大、最具特征的微生物生态系统，在50多个不同的门中有大约500到1000个物种。
- 由五个主要的拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和疣状菌门组成，但以两个拟杆菌和厚壁菌门为主，占90%以上。
- 在属的水平上，拟杆菌是最丰富的。已知人类肠道微生物群在生命早期就已建立，然后可以随着年龄和环境（如饮食和营养）而改变，类似于人类口腔微生物群。因此，口腔和肠道微生物组直接反映了宿主的健康状况。
- 尽管肠道与口腔相连，但肠道微生物群的组成可与口腔微生物群的组成区分开来。在门的水平上，口腔主要由厚壁菌门控制，而粪便微生物群主要富含拟杆菌。这种分离可归因于胃中的胃酸和十二指肠中的胆汁酸。
可以预见口腔鳞癌和结直肠癌的发生与微生物的作用脱不了干系
第三部分：文献中癌变组织的主要检测菌群,我们先看一看口腔鳞癌前四种菌属
口腔样本：Parvimonas
微小微单胞菌(Parvimonas micra,P.micra)是一种存在于口腔、胃肠道、呼吸系统和女性生殖系统黏膜上的革兰阳性厌氧球菌.P.micra 最初也称为微小消化链球菌(Pep-tostreptococcus micros),直到 2006 年被重新分类为小单胞菌属,即微小微单胞菌(Parvimonas micra).微小微单胞菌是慢性根尖性牙周炎最常见的致病菌之一.此外,该细菌还与脑膜炎,宫颈和脑脓肿,感染性心内膜炎,椎间盘感染,肝脓肿,背痈等疾病有关。
口腔样本：Peptoniphilus
不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus)属革兰阳性厌氧球菌,为消化链球菌属,广泛分布于人类口腔、上呼吸道、消化道及生殖泌尿系统,可致免疫功能低下人群患病[1].该菌营养要求较高,临床中常常被忽视.目前国内外关于不解糖嗜胨菌的相关临床报道不多.本例患者既往明确诊断系统性硬化症和类风湿关节炎,其中,系统性硬化症在临床上以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征,随着病情推进,患者多伴有指端缺血坏死症状,部分患者会出现指端溃疡,伤口易感染,严重会引起败血症。
口腔样本：Fusobacterium,厌氧、革兰氏阴性菌，机会致病
梭杆菌属（Fusobacterium），是梭菌门最主要的菌属，厌氧革兰氏阴性细菌，与拟杆菌属、普氏菌属、卟啉单胞菌属一样都是医学上重要的厌氧革兰氏阴性杆菌。
梭杆菌属是人类和动物的身体共生菌之一，主要定植在人类和动物的粘膜中，两个最主要的聚集地是口腔和结肠，某些类型物种属于机会性病原体，会引起菌血症和各种快速进展的感染。这些微生物比大多数正常的厌氧菌群更具毒性，产生重要的 脂多糖(LPS)，内毒素和溶血素等，这可能是毒力的原因。
其中具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum, 简F. nucleatum）和坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum，简F. necrophorum) 是可怕的厌氧病原体之一，最常存在于口腔、牙菌斑中，与牙周病、急性坏死性牙龈炎、口腔癌、溃疡性结肠炎、克罗恩病和结直肠癌有关。
此外，梭杆菌与大约一半的头颈部厌氧菌感染有关，包括牙龈和牙齿感染、慢性扁桃体炎、慢性鼻窦炎、中耳炎、咽旁感染以及口腔感染。它们不仅在这些组织中繁盛，而且很容易扩散，有时会引起肿瘤、息肉、囊肿和其他无害组织块的破坏。即使是局部炎症环境的变化也可能导致无功能组织过度生长，因此也称为“癌杆菌”。
口腔样本：Finegoldia
大芬戈尔德菌，曾称为大消化链球菌，为专性厌氧革兰阳性球菌（GPAC），可定植于皮肤、口腔、上呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道的粘膜。据报道是青春期前阴道菌群的组成部分，且在50%的怀孕妇女的阴道菌群中出现。大芬戈尔德菌是一种条件致病菌，可以导致严重的感染，例如骨、关节、糖尿病足感染、乳腺脓肿、其他皮肤软组织感染、感染性心内膜炎、颈部和颌下腺感染、腹壁筋膜炎（necrotising fasciitis of the abdominal wall）、下肢坏死性筋膜炎(lower limb necrotising fasciitis )等。
第四部分：文献中癌变组织的主要检测菌群,我们看一看结直肠癌前四种菌属
肠道样本：Fusobacterium
梭杆菌属（Fusobacterium），是梭菌门最主要的菌属，厌氧革兰氏阴性细菌，与拟杆菌属、普氏菌属、卟啉单胞菌属一样都是医学上重要的厌氧革兰氏阴性杆菌。
梭杆菌属是人类和动物的身体共生菌之一，主要定植在人类和动物的粘膜中，两个最主要的聚集地是口腔和结肠，某些类型物种属于机会性病原体，会引起菌血症和各种快速进展的感染。这些微生物比大多数正常的厌氧菌群更具毒性，产生重要的 脂多糖(LPS)，内毒素和溶血素等，这可能是毒力的原因。
其中具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum, 简F. nucleatum）和坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum，简F. necrophorum) 是可怕的厌氧病原体之一，最常存在于口腔、牙菌斑中，与牙周病、急性坏死性牙龈炎、口腔癌、溃疡性结肠炎、克罗恩病和结直肠癌有关。
此外，梭杆菌与大约一半的头颈部厌氧菌感染有关，包括牙龈和牙齿感染、慢性扁桃体炎、慢性鼻窦炎、中耳炎、咽旁感染以及口腔感染。它们不仅在这些组织中繁盛，而且很容易扩散，有时会引起肿瘤、息肉、囊肿和其他无害组织块的破坏。即使是局部炎症环境的变化也可能导致无功能组织过度生长，因此也称为“癌杆菌”。
肠道样本：Bacteroides
拟杆菌属（Bacteroides）是指革兰氏染色阴性、无芽孢、专性厌氧的小杆菌。又称类杆菌属。正常寄居于人和动物的肠道、口腔、上呼吸道和生殖道。比较重要的是脆弱拟杆菌和产黑色素拟杆菌。脆弱拟杆菌的菌体大小(0.5～0.8)微米×(1.5～4.5)微米，单个存在或两端相连，主要存在于肠道，比肠内的大肠杆菌多100～1000倍，在临床标本中，为阑尾炎和败血症的常见菌。
肠道样本：Leptotrichia
口腔纤毛菌为革兰阴性长杆菌，大小为(0.8-1.5)μm×(5.0-15.0)μm，菌体直或微弯，一端或两端尖，常呈链状或成对排列，中间有丝状体相连。菌体内有革兰阳性颗粒(紫色颗粒)，沿菌体长轴分布。幼龄培养物可染成革兰阳性。无鞭毛，无动力,也是一种致病菌
肠道样本：Gemella
Gemella属。
可见微生物和人类也存在密切的关系。
第二部分，检测微生物在肿瘤组织中的小生境
鉴于肿瘤内菌群在单个肿瘤组织中具有异质性分布，试图确定这种空间分布是否与TME内的不同功能相关（DSP技术）,这里当然选择了丰度最高的前几种微生物。
这里我们需要注意的是一些基本的知识：
PanCK和CD45抗体是常见的免疫区域染片的抗体。
抗平滑肌抗体(SMA)是以机体平滑肌组织为抗原的一种抗体，用来染组织细胞区域。
SYTO13是常见的荧光通道抗体，是一种荧光染料。
这里通过几种抗体染片的配合，就可以选择特定的区域。然后DSP技术测序得到相应区域的转录组信息。差异比较分析得到小生境的差异。
根据这些基因的差异表达，可以推断出小生境主要的细胞类型组成。
第三部分，单细胞角度的微生物研究
这部分通过RNAscope技术可以看到主要的菌种有两种形式，1种是黏附在细胞表面，另外一种是进入细胞内，不同的细胞类型菌类分布也不一致。通过研究单细胞微生物（INVADEseq）的测序分析结果，在患者肿瘤中识别细胞相关细菌和与它们相互作用的宿主细胞，并发现了与炎症、转移、细胞休眠和DNA修复有关的转录通路的改变。总之，肿瘤内微生物群的细胞相关成员在免疫和上皮细胞群的单细胞水平上驱动了患者肿瘤的异质性。
菌类的侵入也改变了细胞内部的基因表达
Bacteria-induced migration of cancer cells
为了评估肿瘤内微生物群的显性组成与免疫或上皮癌细胞的直接相互作用，使用了还原共培养方法。
首先时中性粒细胞的“叛变”，在F. nucleatum的引导下聚集在肿瘤细胞内。
中性粒细胞在肿瘤中的作用
中性粒细胞在肿瘤中的作用非常复杂，影响肿瘤的生长和转移，可能导致促肿瘤或抗肿瘤效应。肿瘤中通常有大量的肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils），分为抗肿瘤（N1）或促肿瘤（N2）表型。中性粒细胞在肿瘤中的整体作用是由肿瘤相关中性粒细胞和整体中性粒细胞（循环和骨髓中的中性粒细胞及未成熟的中性粒细胞）共同介导的。虽然中性粒细胞增多在实体肿瘤中是不良预后标志，但尚不明确是中性粒细胞促进肿瘤进展，还是晚期肿瘤的全身炎症反应继发的中性粒细胞增多。中性粒细胞也可参与到肿瘤相关次生事件中，如肿瘤相关血栓的形成和远处器官的衰竭。
中性粒细胞在不同条件下具有促肿瘤和抗肿瘤作用。中性粒细胞参与不同阶段的肿瘤发生，例如：中性粒细胞弹性蛋白酶介导的降解IRS1可促进肿瘤细胞增殖，一种特别的成骨细胞依赖的中性粒细胞群体可促进肿瘤细胞生长，中性粒细胞可抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫以及中性粒细胞通过吸引趋化因子/趋化因子受体促进肿瘤转移级联反应。最近的研究揭示了中性粒细胞在促进肿瘤转移中的重要作用，它可促进易转移肿瘤细胞亚群的增殖， 支持远处位点（转移前龛）的准备，便于转移细胞植入并使休眠肿瘤细胞在转移部位觉醒。中性粒细胞的促肿瘤机制包括：促进血管生成、NETs、中性粒细胞样MDSCs抑制T细胞介导的抗肿瘤作用。同时，中性粒细胞可发挥抗肿瘤作用，例如：MET可介导抗肿瘤中性粒细胞的招募，中性粒细胞抑制转移和早期肿瘤的生长，肿瘤相关中性粒细胞可增强效应T细胞的活性，某抗原呈递中性粒细胞亚群具有抗肿瘤活性。然而，在肿瘤病程中肿瘤相关中性粒细胞的表型可以由抗肿瘤N1型转变为促肿瘤N2型。事实上，中性粒细胞的抗肿瘤活性通常作用于肿瘤早期，而与多形核MDSCs相关的强免疫抑制（促肿瘤）主要表现在晚期。
中性粒细胞促进了肿瘤转移。通过研究主要菌群与细胞类型之间的相互作用，表明来自人类CRC的F. nucleatum能在细菌感染部位积极诱导骨髓细胞的招募，并促进CRC上皮细胞的转录变化，从而促进对周围环境的入侵，并可能赋予静止特性。
Discussion
从历史上看，肿瘤异质性仅归因于癌细胞在克隆扩增期间的内在遗传改变。20世纪90年代的研究表明，TME衍生的外源性因素在肿瘤发生中起重要作用。癌细胞与TME中其他非恶性细胞群(如成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞)之间的细胞间相互作用，随着癌症的发展，促进转化细胞的转录组变化，从而导致肿瘤异质性。随着对TME的理解不断深入，对影响肿瘤异质性的因素的理解也在不断加深。基于基因组学的研究表明，大多数主要类型的人类癌症都含有肿瘤内微生物群。这些微生物群落因癌症类型而异，特定的细菌可以促进癌症的发生和发展，影响患者对治疗的反应，从而影响生存。然而，存在的内在异质性使得很难理解TME的不同成分之间的相互作用，包括原生组织环境中的细菌-宿主相互作用。空间转录组学和scRNA-seq技术的发展使TME的真核成分得以研究，但肿瘤内微生物群在TME中的作用迄今为止被忽视了。在这项研究中，通过适应和应用这些技术，得出结论，肿瘤内微生物群在人类肿瘤中是异质性分布的。此外，我们表明它是TME的一个基本成分，可以改变不同细胞类型的生物学，影响抗肿瘤免疫和癌症上皮细胞的迁移。通过激活JUN和FOS家族的转录因子，细胞内细菌可以产生与癌细胞侵袭、转移、DNA损伤修复和细胞休眠一致的基因特征。同样，侵入性细菌负责招募骨髓细胞，通过JAK-STAT信号传导诱导炎症反应，通过分泌特定的白介素和趋化因子到周围环境中促进T细胞排斥和肿瘤生长。虽然在这里关注的是两种极端的胃肠道癌症类型，但所描述的工具和技术可以应用于分析迄今为止已被证明含有肿瘤内微生物群的33种主要癌症类型。分析超越了微生物群与人类癌症的相关关系，转向了那些评估肿瘤内微生物群功能效应的分析，将确定预防和治疗此类癌症的分子和细胞靶点。总的来说，这项工作表明，患者肿瘤内肿瘤内微生物群的分布不是随机的，而是微生物群在微微池中高度组织，具有支持癌症进展的免疫和上皮细胞功能。
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