随着基因工程和细胞生物学研究的不断发展,将siRNA导入真核细胞的转染技术,已成为研究基因功能、调控基因表达和突变分析等生物学试验的一种重要手段。目前,能够将siRNA导入细胞的方法主要有物理介导(电穿孔法、显微注射和基因枪)、化学介导(磷酸钙共沉淀法、载体转染等)以及生物介导(原生质体转染、病毒转染)三种途径。但由于物理介导法对细胞的伤害很大且需要借助特殊设备,而生物介导法的准备程序又比较复杂,并且常常对细胞类型有很强的选择性,因此,化学介导法成为实验室最常用的方法,其中又以载体转染法最为普遍。
市面上大多数的转染载体都是脂质体类载体,这类载体对细胞的毒性比较大,转染效果有时也不够理想。但随着纳米生物材料的发展,利用该种材料研发的转染载体不仅拥有极低的细胞毒性,在转染效率上也有非常不错的表现,以下是几种目前实验室最常用的siRNA转染试剂。
一、Lipofectamine 3000
Lipofectamine 3000是一款市场占有率和知名度都很高的转染试剂。该款产品采用了脂肪纳米微粒技术,它属于一种脂质体类的转染试剂。大家都知道Lipofectamine 2000原先是十分受欢迎的,但由于细胞毒性较为明显,其推广应用受到较大影响。Lipofectamine 3000较Lipofectamine 2000在成分上做了优化,细胞毒性和Lipofectamine 2000相比,要小了很多。尽管如此,Lipofectamine 3000对部分细胞还是存在较为明显的细胞毒性的。虽然其说明书表述该试剂对细胞作用温和、转染后非必需换液,但大多数科研者在分享转染经验时还是建议转染后6-8小时更换培养液,如果不及时更换新鲜的培养基,细胞死亡率还是比较高的,可达20-30%左右。不过,对于一些耐受性强的细胞,Lipofectamine 3000还是有比较不错的转染效率的。因而,研究者在选择使用Lipofectamine 3000时,需要考虑所要转染的细胞对脂质体的毒性是否耐受。
此外,使用Lipofectamine 3000进行转染复合物配制时,需要使用特殊培养基--Opti-MEM减血清培养基,来分别稀释转染试剂与小核酸进行配制。实验者需要额外购买这种减血清培养基。
二、Lipofectamine RNAi MAX
Lipofectamine RNAi MAX,是目前国际公认的最为权威的siRNA转染试剂之一。在赛默飞现售的所有转染试剂中,RNAi MAX的转染密度要求是最低的,细胞融合度在30-50%时就可以进行转染,而像Lipofectamine 2000/3000都要求融合度在70-90%之间转染。其实,要想知道一个转染试剂的毒性通过它的转染密度要求就能看出来,这也从侧面反应出,RNAi MAX的细胞毒性是更低的。
并且,相较Lipofectamine 3000,RNAi MAX做到了低siRNA浓度下就可获得优良的转染效果,转染性能又上了一个台阶。但是,实验者使用RNAi MAX转染试剂进行siRNA转染,转染后一般无需换液,但配制转染复合物时依旧需要额外购买Opti-MEM培养基。
作为这样一款高性能的siRNA转染试剂,RNAi MAX的售价自然不菲,其一支1.5mL规格的转染试剂,定价已逾万,这点对于很多经费有限的实验者来说往往需要考虑再三。
三、RFect V2 siRNA转染试剂
RFect V2 siRNA转染试剂是在RFect siRNA转染试剂基础上的升级产品,目前受到很多实验室的肯定。该试剂以新型可降解纳米材料为主要成分研发而成,区别于市场上的脂质体类转染试剂如Lipofectamine 3000、RNAi MAX。
升级后的RFect V2 siRNA转染试剂在各方面都有显著的提升。细胞毒性上,使用RFect V2 siRNA转染试剂在细胞融合度30-50%之间进行转染,转染后细胞死亡率只有5%左右,比RFect要更低,似乎还略优于RNAi MAX。转染效率上,Rfect V2 siRNA转染试剂盒里配置有专研的siRNA转染增强剂,能够有效降低细胞膜的免疫排异反应,从而提升siRNA转染的效率。实验数据显示,Rfect V2在很多贴壁细胞中的mRNA敲除效率可高达95%左右,比Rfect小核酸转染试剂要高出5-30%。我们将RFect V2和RNAi MAX分别转染小核酸NC-FAM到Hela细胞中,比较两个试剂的转染效率,结果发现,两者的转染效率皆达到了90%以上,难分伯仲。
另外,使用RFect V2 siRNA转染试剂不需要搭配如Opti-MEM这类特殊的培养基,其siRNA转染增强剂可完全替代无血清培养基配制转染复合物,转染效果更好。同时,血清对Rfect V2的转染效果也没有影响,也不必在转染4-6小时后换液,这些方面增加了实验的方便性,更有利于研究者使用。