插入片段
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什么是“插入片段”？
插入片段
历史
“插入片段”，英文中用“Insert”来表达。在利用大肠杆菌（E.coli）作为容器进行DNA克隆的时代，Insert指的是把一段DNA序列植入到大肠杆菌的基因组中，利用大肠杆菌扩增。这个被植入的片段就叫插入片段。在NGS中，扩增依然是刚需，但载体早以不再是大肠杆菌，由于形式有些类似，这个词也就一直沿用。
测序步骤
在二代短序列高通量测序中第一步是构建适当的DNA测序文库。构建步骤一般如下：
- 利用超声或者酶切技术把那些从细胞中提取出来的DNA打断，然后末端修复，把分叉的末端序列修平；
- 凝胶电泳。由于不同长度的DNA分子片段所带电量（它们都带负电荷）不同，在电场作用下，一段时间之后不同长度的DNA片段就在电场中分开
- 在2的基础上，挑选特定长度的DNA——比如挑选400bp长度的序列，就是要测序的主体序列，也就是要被植入的“插入片段”。只不过在二代测序中，不是植入到大肠杆菌里了，而是在它们的两头分别加上测序用的接头（adapter），然后进行（PCR）序列扩增，最后再上机测序，这个加完接头之后的样子，如图所示。
inner distance& insert size
整个片段（Fragment）中，两端深蓝色部分是测序接头（adapter），中间浅蓝色是DNA序列，也就是所谓的插入片段，插入片段长度（Insertsize）指的就是浅蓝色部分的长度。它两端所加的接头主要有两个作用：
第一个是类似于“手”的作用，很重要，目的是让DNA序列能够通过这些接头和测序芯片上的“测序位”相互“抓握”，并固定好完成测序过程；
第二个作用是样本区分，这个发生在多样本混合在同一个机器上进行测序时——也就是通常所说的pooling测序，才需要用到。
测序接头的结构其实更复杂，为了表述方便做了简化。
中间浅蓝色插入片段的序列，它的真实长度，是没办法精确知道的，只能通过测序。但二代短读长测序技术，又只能从这个淡蓝色片段的一个末端或者两个末端开始测，比如图中是Pair-End(PE)测序，测的是两个末端，得到的序列是Read1和Read2，很多时候Read1+Read2的长度都是小于这个插入片段的长度的。在不测通的情况下，它中间一定有一段不明长度的序列我们无法测到，这段不被测到的序列有时被称为Inner序列，它的长度是Read1和Read2相距的距离（图2中红色双箭头所指的序列）。
*在二代短读长测序（Illumina或者BGISEQ系列等）时，无论是WGS、WES、WGBS、RRBS还是RNAseq，都有两个不同的测序类型可以选择：单末端测序（Single End，简称SE）和双末端测序（Pair-End，简称PE）。
overlap
Read1和Read2有时是会发生重叠的，这个重叠并不是指两个序列相连了（测序的时候，Read1和Read2是分开生成的，而不是两端同时开始测，所以不可能相连），而是相互测到了对方覆盖的片段了，如下图。这是怎么发生的呢？有两种情况会导致这个现象的发生：
- 第一，测序读长较长，比如MiSeq的测序读长可以到达250bp，PE测的话，Read1+Read2就达到500bp，如果我们的建库序列长度是400bp，那么就会被测通，而且中间有约100bp是Read1和Read2重叠测到的区域（图中红色Overlap区域）；
- 第二，建库时带来的误差。构建测序文库的插入片段，做不到长度基本一致。下图是一个真实数据的插入片段长度分布图，这不是一个很好的建库结果，左端有一大段长度都在200bp以下，甚至还低至50bp。
合并这类重叠的Read也有一些工具可以使用，比如 Pandaseq Tutorial 0.0 documentation
测通
除了Read重叠之外还有一种情况，叫做：测通。有些插入片段长度太短了，导致Read能够完全跨越整个插入片段，比如图里，所有长度小于100bp的插入片段，它们都会被测通，而且还会直接测到片段两端的接头序列。如下图，就是一个序列测通的示意图，这是Read中存在接头污染的主要来源。
这也是为什么接头序列一般都是出现在Read的末尾的原因，我们需要cut adapter也是这么来的。
测序质量并不直接受插入片段长度所影响，而是受试剂、测序芯片、光学相机、机器运行情况等更加复杂的系统和外部因素所决定的。
双末端测序(Pair-End)获得的Read1和Read2包含了三个非常有用的关系信息，分别是：彼此相连，距离和序列方向。这些信息是基因组变异检测特别是结构性变异检测的关键信号。
基因组组装
虽然adaptor不会被测序，但如果fragment太短，被读通了，则另一端的adaptor就会被测到。
tiny fragment ~~~~========================~~~~
insert ========================
R1 -------------------------->
R2 <--------------------------
read-through !!! !!!
如果MiSeq设置正确，读通的adaptor会被切除，获得长度不一致的short reads，也可以使用N来替换adaptor序列，这样长度一样，但会在5' end看到很多N。如果没设置好，reads里含有adaptor序列，那么必须要通过软件去除，否则后续的分析都会有问题。
所以insertion size小，测序的genome coverage高，但是在进行de novo assembly的时候，有一个问题，如果基因组含有比read length还要长的重复元件时，就无法拼接，所以得到的是很多的contigs，它们之间的gap要长于insertion size且无法确定。这个问题是相当普遍的，即使是相对简单的ecoli基因组，也有一定数量的重复元件。
这个问题需要使用大的insertion size进行paired end测序来解决。
fragment + adaptors ~~~========================================~~~
PE reads R1---------> <---------R2
unknown gap ....................
在这种insertion size比较大的情况下，我们可以估计R1和R2之间的距离，只要有一个片段能够被mapped到unique position的话，那么另一个片段的大致位置就可以确定。所以为了达到好的拼接效果，长fragment的library也是必须的，它有可能给出 contigs间的相对位置。
所以理想的情况是使用multiple insert libraries，short-insert library可以保证获得足够的coverage，它可以告诉你contigs之间的序列，但信息是local的，它没办法告诉你怎么拼；而long- insert libary则可以告诉你一些相对global的信息。
在基因组组装的场景中，设计梯度文库时，一般都会有一个小长度文库，目的就是把这个小长度文库的Read1和Read2连起来，合成一条超级Read，这样可以协助进行序列构建和补洞，把物种基因组装的更好。
