作者，追风少年i

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今天我们继续单细胞空间的分析内容，参考文章在Monocyte-macrophage spatial dynamics promote pre-crown-like niches in early obesity,单核细胞 - 巨噬细胞空间动力学促进早期肥胖的前冠状生态位,密歇根大学的研究成果，我们来看一下。

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Abstract

肥胖会导致脂肪组织发生显著变化，这些变化先于组织和全身性胰岛素抵抗的发展。 免疫细胞浸润和炎症是这些变化的已知促成因素，但对其在组织范围内的空间背景了解有限。 研究试图在小鼠饮食诱导肥胖的时间过程中确定附睾脂肪组织免疫细胞的空间模式。

使用空间转录组学和单细胞 RNA 测序，确定了保存在其解剖环境中的主要细胞类型特征，量化了整个脂肪组织中的基因表达模式，进行了细胞类型网络分析，并研究了配体-受体共定位。

数据分析发现增加的先天免疫细胞，包括巨噬细胞、单核细胞和先天淋巴细胞，并在组织范围内散布，并抑制肥胖导致的适应性免疫细胞特征。 网络分析确定所有主要免疫细胞类型的异质性增加，与增加的亚型一致。 为了捕捉肥胖开始时的组织动力学，借鉴了线性代数和谱图理论的数学原理，并为更好地理解细胞协作以实现多细胞组织功能的出现提供了一个框架。

这些分析的重点揭示了配体 - 受体活性的广泛范式转变，在早期肥胖症的脂肪组织中，在冠状结构上几乎排他性巨噬细胞 - 巨噬细胞或单核细胞 - 巨噬细胞相互作用。

Introduction

全球肥胖的增加引起了人们对心血管和代谢疾病的发展、病毒感染不良事件风险增加以及经济和医疗保健成本的严重关注。 白色脂肪组织 (WAT) 免疫细胞类型和极化的变化发生在肥胖症中，并与小鼠和人类的代谢功能障碍有关。

群体和单细胞转录组学能够对 WAT 免疫细胞中这些与肥胖相关的变化进行低偏差表征。 然而，触发组织功能障碍的分子事件在其解剖学背景下仍然知之甚少，而这些解剖学背景随着组织消化而丢失。 组织免疫染色捕获解剖背景，但仅限于少数可能无法完全区分具有相似表面蛋白的细胞的并发标记。 在脂肪组织中，巨噬细胞 (ATM) 和树突状细胞 (ATDC) 一直难以区分，但它们在组织稳态和胰岛素抵抗发展中具有独特的参与作用。 因此，组织图谱中免疫细胞和亚型的低偏差捕获对于识别与疾病相关的功能差异至关重要。

空间转录组学 (ST) 捕获跨组织切片的基因表达特征，这在肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 的研究中导致发现新的解剖亚区域和组织功能障碍的时空模式。 ST 最近被用于分析不同的脂肪细胞亚型，这些亚型对人体脂肪组织中的胰岛素刺激具有不同的反应。在这里，使用空间转录组学和单细胞 RNA 测序的组合绘制了肥胖中的小鼠脂肪组织和免疫细胞群。在饮食诱导的肥胖和糖尿病前期状态的发展过程中，主要目标之一是在出现组织功能障碍时捕捉早期免疫细胞浸润的动态。将组织图谱呈现为细胞网络，并研究早期肥胖症的空间模式和细胞间通讯。分析结果发现了早期单核细胞浸润、单核细胞和巨噬细胞串扰的渐进优势以及适应性免疫细胞特征的抑制。此外，配体-受体分析显示，通过 8 周的高脂肪饮食喂养，在前冠样解剖区域中假定的单核细胞 - 巨噬细胞相互作用，暗示单核细胞信号传导在冠样结构发育中的作用不同于它们分化为 ATM 的作用。

Results

Spatial analysis of adipose tissue across early obesity（早期肥胖脂肪组织的空间分析）

使用正常饮食 (ND)、高脂饮食 8 周 (8w) 和高脂饮食 14 周 (14w) 的小鼠评估了饮食诱导的肥胖模型中的组织和代谢功能。 正如预期的那样，喂食高脂肪饮食 (HFD) 的小鼠体重增加了体重和附睾白色脂肪组织 (eWAT)。 葡萄糖耐量测试 (GTT) 显示曲线下面积 (AUC) 从 HFD 喂养一周开始增加，在中间时间点具有最高的 AUC 和变异性。 脂肪细胞大小显示在 8w 和 14w 队列中大脂肪细胞的频率增加，平均脂肪细胞大小更大。 这些数据与这种 HFD 喂养模型的糖尿病前期一致，显示 HFD 喂养期间的早期胰岛素抵抗和与脂肪组织动态重组一致的可变胰岛素抵抗时期。

小鼠饮食诱导的肥胖中 SVC 的变化包括免疫细胞浸润和激活，这会逐渐破坏体内平衡机制。 为了捕捉这种不断变化的组织图谱，进行了时空分子分析，这可以揭示组织功能分解的关键模式。 在这里，使用 Visium (10X Genomics) 空间转录组学 (ST) 平台对来自 ND 和 HFD 喂养小鼠的 eWAT 切片进行空间分析。 最初评估了预期的免疫细胞和肥胖相关基因表达，发现泛免疫细胞 Ptprc(CD45)、骨髓相关 CD68、募集 ATM 标记 Itgax (CD11c)、常驻 ATM 标记 Mrc1 和 Trem2 增加，其表达于 脂质相关的 ATM 并提出了保护性脂质稳态的功能。 在 HFD 喂养条件下，Adipoq（人脂联素基因） 如预期的那样逐渐下降。

Diet-induced obesity and adipose tissue remodeling

• 图注：(A) Time course for mice fed a 60% high-fat diet (HFD) for 8 weeks (8w) or 14 weeks (14w), versus normal diet (ND) controls. Measurements included weight gain (B), final body weight (C), epididymal adipose tissue (eWAT) weight and eWAT as a percentage of body weight (D), and glucose tolerance test data showing area under the curve (AUC) across time points (E) and glucose measurements for cohorts one week prior to endpoint tissue collection (F). (G) Frequency distribution and average adipocyte size in eWAT of ND, 8w, and 14w cohorts. (H) Representative images from H&E staining of eWAT and liver. (I) Representative maps showing spatially preserved gene expression in eWAT. Each spot is a 55 μm diameter transcript capture area from a tissue section, colored corresponding to the expression level (log2-transformed) of select obesity-related genes. (J) Gene expression changes in HFD-fed mice compared to ND mice corresponding to the genes shown in part (I). Upper graph, log2(fold change) in the quantity of spots in HFD cohorts; Lower graph, log2(fold change) in average tissue-wide expression of a gene in HFD cohorts.

Breakdown of adipose tissue immune cell networks in early obesity（早期肥胖中脂肪组织免疫细胞网络的破坏）

多个细胞可以为每个空间数据spot提供转录本，因此同时在 SVC 中进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)，以阐明免疫细胞类型的变化并促进空间数据中的特征识别（单细胞空间联合）。 考虑到表达和唯一性，使用光谱聚类和分析每个cluster的特征基因来识别 scRNA-seq 数据中的细胞类型。 通过与 ImmGen 配置文件alignment，进一步验证了细胞类型特征。 为了识别spot中存在的细胞类型，整合了 scRNA-seq 和 ST 数据集，确定细胞类型特征和组织斑点基因表达之间的重叠。

Workflow of spatial transcriptomics (ST) and single-cell RNA-sequencing (scRNAseq) data analyses

Spectral clustering和数据引导的细胞类型识别产生了六种广泛的免疫细胞类型：单核细胞、T 细胞、ATM、ATDC、自然杀伤细胞 (NKC) 和 B 细胞。 瘦小鼠和肥胖小鼠脂肪组织细胞组成的变化主要是由 T 细胞、B 细胞和 ATM 驱动的，其中被归类为 T 细胞和 B 细胞的单细胞比例随着肥胖而降低（T 细胞为 17% 至 5%） 细胞和 B 细胞 （22% 到 3%），而归类为 ATM 的比例急剧增加（43% 到 76%）。 这些发现与之前在饮食控制的小鼠模型中对免疫细胞群的 scRNA-seq 研究一致，其中观察到了相同的免疫细胞组，并且单核细胞和 ATM 是存在的主要类群。

接下来在瘦和肥胖的脂肪组织中建立了细胞类型定位模式。细胞类型根据其特征在该点表达的比例被分级分配给组织spot。这样，一个spot的优势细胞类型是其代表基因表达数量最多的细胞类型。所有spot上的优势细胞类型构成了优势层或第 1 层。第 2 层被分配为具有第二高数量的特征基因表达的细胞类型，其余细胞类型以相同的方式分配到后续层。此分配的结果是一系列层，表示给定细胞类型在特定位置存在的可能性降低。将此过程称为点反卷积，并将产生的组织分配层称为“反卷积层”。随着时间的推移，主导层中的细胞类型定位与来自 scRNA-seq 数据的细胞组成趋势一致，表明在 HFD 环境中 T 细胞和 B 细胞减少，ATM 增加。

(A) Cellular composition. UMAP projections of scRNA-seq data over time, stratified by cell type. Gray points represent the UMAP projection from pooled clustering of all three samples and colored points represent sample-specific single cells. (B) Spatial tissue patterning. (Top) H&E staining of adipose tissue sections. (Bottom) Zoomed view of annotated ST-derived tissue landscapes. Cell type assignments represent the dominant spot assignments after performing spot deconvolution. White spaces with no spots indicate non-viable areas of the tissue where there were visible holes and therefore no detectable mRNA levels

Deconvoluted tissue assignment layers

• 图注：Annotated spatial transcriptomics tissue landscapes over time, zoomed in for clearer view of cell type composition and distribution. Cell type assignments in the left panels represent the dominant spot assignments after performing spot deconvolution (i.e. Layer 1). (Rightmost panels) Non-dominant deconvoluted layers (Layers 2 - 6) of tissue spot assignments for zoomed in region. Light gray spots represent spots that were unassigned because no remaining cell types met the gene expression threshold.

Spatial network patterning highlights activation of innate and dampening of adaptive immune cell signatures（空间网络模式突出了先天的激活和适应性免疫细胞特征的抑制）

炎症是肥胖中脂肪组织功能障碍和胰岛素抵抗发展的关键因素。适应性和先天免疫系统的细胞都有助于脂肪组织中的炎症过程，包括 T 细胞、B 细胞、ATM、ATDC 和先天淋巴细胞 (ILC)。这种细胞网络及其亚型通过细胞因子和趋化因子分泌以及细胞间相互作用来调节炎症，随着时间的推移减少抗炎信号传导并促进促炎细胞类型和过程。为了广泛比较肥胖症中适应性和先天性免疫细胞网络的模式，空间数据中的每个组织spot被分类为适应性（T 细胞、B 细胞）、先天性（单核细胞、NKC、ATM 或 ATDC）或混合类型基于前两个组织分配层。发现仅包含适应性免疫细胞的spot随着肥胖而持续下降，从 21% 降至 6%（3.5 倍变化），而仅包含先天免疫细胞的spot随着肥胖而增加，从 1%到 14w 时下降到 9%（9 倍变化），这与已知的 HFD 喂养的细胞结构变化一致。在所有spot中，75%-85% 具有混合类型特征，肥胖者的频率更高。总体而言，这些数据表明脂肪组织先天免疫细胞的影响比肥胖的适应性免疫细胞更强，通过增加数量和频率、强大的空间散布以及增加与适应性免疫系统的交叉作用的可能性。

Immunity dynamics. Stacked bar plots representing cell type proportions at tissue spots assigned to adaptive or innate immune cell types at each timepoint (denoted by orange and teal vertical bars to the left of the plots). Tissue spots were classified as contributing to adaptive immunity if adaptive cell types colocalized at the spot, meaning deconvoluted tissue assignment layers 1 and 2 (L1 and L2) were assigned as T cell or B cell for those spots. Tissue spots were classified as contributing to innate immunity if innate cell types colocalized at the spot, meaning L1 and L2 were assigned as ATM, monocyte, NKC, or ATDC. Remaining tissue spots were classified as ambiguous tissue regions where L1 was assigned an adaptive cell type and L2 an innate cell type, or vice versa, and are not shown in the figure. Each stacked bar represents a single tissue spot. The height of each component in a stacked bar reflects cell type proportions (the number of genes expressed out of each 50-gene cell type-specific signature). Below plots is a model of the observed adaptive and innate immunity trade-off during obesity progression. We propose that obesity weakens the adaptive immune system and innate immunity concurrently compensates for that weakened immune response over time.

Turing-inspired analysis reveals increased interconnectivity among monocytes and macrophages（图灵启发的分析揭示了单核细胞和巨噬细胞之间的相互联系增加）

为了进一步评估免疫细胞如何促进多细胞组织功能的转变，在细胞水平上描述了细胞内和细胞间类型的关系，并在基因组水平上确定了细胞类型群体内的转录多样性。为了模拟这种组织形态发生，引入了图灵系统的概念。简而言之，图灵系统考虑了细胞间和细胞内动力学对新兴组织功能的协调作用。在这里，根据来自 ST 数据的欧几里德距离加权的位置特异性基因表达谱之间的相关性来表征细胞间动力学，以及根据来自 scRNA-seq 数据的单细胞基因表达谱之间的相关性来表征细胞内动力学。然后，通过计算每种免疫细胞类型的细胞和基因组连接性之间的权衡，分别从细胞间和细胞内动力学得出，根据单个细胞类型的贡献捕获了新兴的组织功能。结果与巨噬细胞和单核细胞对肥胖中不断变化的脂肪组织图谱的贡献增加一致。

Overview of Turing-inspired model for describing adult adipose tissue dynamics

为了确定细胞类型对以潜在协调的方式对组织功能的贡献——多细胞组织功能的出现——通过全局组织功能的出现（来自所有细胞类型的合并数据的细胞和基因组连接性权衡）对局部组织功能的出现（来自两种细胞类型的合并数据的细胞和基因组连通性权衡）进行了标准化。 虽然大多数细胞类型的相互连接表现出与肥胖的减少或稳定耦合，但单核细胞 - 巨噬细胞和单核细胞 - 树突状细胞之间的细胞间类型贡献在肥胖中增加。 此外，巨噬细胞的相互连接性总体上很高，特别是与其他先天免疫细胞类型，而 B-T 细胞轴具有最低的细胞间类型连接性之一，随着时间的推移而降低。

HFD 喂养中增加的单核细胞-巨噬细胞和单核细胞-树突状细胞的细胞间类型关系可能反映了与单核细胞分化或这些细胞之间的串扰相关的特征。 进一步探索了关键骨髓细胞标志物的分布，发现常见单核细胞（Traf1、Ccr2、Il1b、Napsa、Plac8、S100a9、Msrb1、Ifitm6、Ms4a4c、Cd209a）和巨噬细胞（Adgre1、Ctsk、Lyve1、Cd209f、 Mertk、Ccl8、Trem2、Cd63、Mmp12、Gpnmb、Rhoc、Ctsd、Mfge8 ) 标记在整个组织中，表明未分化的单核细胞与巨噬细胞合作在肥胖症中的潜在作用。 相比之下，B 细胞和 T 细胞标记共定位之间几乎没有重叠，这与肥胖的 B 细胞-T 细胞相互连接性低且降低一致。

接下来评估了单核细胞和巨噬细胞之间的转录相关性随着时间的推移而增长，作为谱系关系的指标。 单核细胞和巨噬细胞表达谱之间的相关性从 R = 0.25 非随机增加到 R = 0.30 (p < 0.01)。 虽然这支持单核细胞向巨噬细胞分化，但相关性的程度很低，可能是由于这些群体中亚型的多样性增加。 总体而言，这些数据支持单核细胞-巨噬细胞串扰的存在以及单核细胞的持续分化。

(D) Tissue dynamics. (Left) Individual cell type contributions to tissue function (normalized to sum to 1). Intra-cell type interactions are quantified by computing the tradeoff between cell and genome connectivity for each cell type. (Right) Prominent inter-cell type relationships. Inter-cell type interactions are quantified by dividing the tradeoff between cell and genome connectivity for two cell types by the the tradeoff between cell and genome connectivity for all cell types. (E) Inter-cell type spatial distribution. (Boxed in orange) Monocyte (red) and macrophage (blue) spot assignments in the dominant tissue assignment layer. Directly below each plot is a sample region of the tissue showing where monocyte- and macrophage-specific markers localize. A high color intensity indicates a high proportion of monocyte or macrophage-specific markers at the spot. Purple colored regions indicate spots where both monocyte and macrophage markers were found and represent inter-cell type interaction. (Boxed in teal) B cell (red) and T cell (blue) spot assignments in the dominant tissue assignment layer. Directly below each plot is a sample region of the tissue showing where B cell and T cell-specific markers localize. A high color intensity indicates a high proportion of B cell or T cell-specific markers at the spot. Purple colored regions indicate spots where both B cell and T cell markers were found and represent intercell type interaction. (F) Monocyte-Macrophage differentiation. Stem plot of Spearman correlation (R) between monocyte and macrophage single-cell gene expression profiles in lean versus obese mice. Red stems are the real observed Spearman correlation coefficients in normal diet (left) and high-fat diet (right) mice. Gray stems are the background distribution of Spearman correlation coefficients between randomly-selected single-cell gene expression profiles.

Increased heterogeneity of signatures within immune cells captures phenotype shifts across adipose tissue（免疫细胞内特征的异质性增加捕获了脂肪组织中的表型变化）

肥胖促进免疫细胞极化的变化和影响组织功能的亚型的出现。 在小鼠中，ATM 相对于组织重量的比例增加以及体重增加和减少期间的增殖和凋亡模式表明稳态信号传导的活跃机制最终可能被慢性肥胖所覆盖。 假设在时间过程数据中评估免疫细胞网络将提供对破坏脂肪组织功能的表型变化的洞察。

为了更好地量化这些变化，为每种主要细胞类型构建了空间细胞网络，其中节点是基于优势层分配给细胞类型的组织点，节点之间的边缘表示基于转录特征的相关性。令人惊讶的是，肥胖的细胞类型网络边缘普遍减少，表明同一类型细胞之间的转录相关性丧失。这与细胞类型特异性特征基因表达的异质性增加同时发生。空间模式的丧失和异质性的增加支持肥胖中免疫细胞亚型的出现，而这些亚型在瘦状态下不存在。巨噬细胞尤其表现出许多表型状态。在将巨噬细胞分类的单细胞聚类成两个亚群时，两个群中只有一个在正常饮食环境中出现，而在两种高脂肪饮食环境中都存在。 HFD 环境中出现的cluster在 Cd9 中显著富集（log2FC 为 11.8），此前已在肥胖的富含脂质的巨噬细胞中观察到这一点。与观察到的巨噬细胞亚群相比，T 细胞、B 细胞和 NKC 亚群不太明显，差异表达的基因较少。

Network nodes represent transcriptionally correlated tissue spots assigned to the cell type in the dominant tissue assignment layer. Color intensity of network nodes represents the number of cell type-specific signature genes expressed at the spot. The upper bound of the color bar is the maximum number of signature genes (out of 50) expressed at any given spot across all three tissue settings. Network edges represent high correlations (correlation coefficient ≥ 0.85) between cell type-specific gene expression profiles at two spots

Monocyte and macrophage ligand-receptor pairs dominantly colocalize in obese adipose tissue（单核细胞和巨噬细胞配体-受体对主要位于肥胖脂肪组织中）

为了更好地了解可能介导肥胖症中空间模式变化的特定相互作用，评估了配对配体和受体随时间的共定位表达。 首先捕获了适应性和先天类别中的配体和受体表达，表征了四种相互作用状态：（1）适应性配体和适应性受体，（2）先天配体和先天受体，（3）适应性配体和先天受体，以及（4）先天 配体和适应性受体。 对于这项研究，确定已知配体-受体对的转录本共定位作为细胞间通讯的代理，作为每个组织spot的受限区域。

从文献中查询已知的配体-受体 (LR) 对，观察到随着时间的推移，整个组织的共定位增加，共定位spot的数量和每个共定位点的 LR 对的数量都在增加。从 scRNA-seq 数据中，发现了分别表达共定位对的配体和受体的适应性单细胞的比例，以及分别表达共定位对的配体和受体的先天单细胞的比例。这能够推断来自适应性、先天或两者相互作用的信号交互是否有助于我们在瘦和肥胖脂肪组织之间看到的变化。通过取自适应或先天来源的配体和受体的所有成对组合之间的平均比例来定义每个状态的分数。该分数表示 LR 对在特定类型的细胞类型内（或之间）表现出信号活性的可能性。然后，对于每个共定位的 LR 对，我们确定了四种相互作用状态中哪一种表现出最高分，并发现配体-受体对的百分比主要参与适应性配体-适应性受体、适应性配体-先天受体和先天配体-适应性受体信号在肥胖进展期间减少，而主要参与先天配体-先天受体信号的对的百分比增加。

执行了相同的步骤来探索不同细胞类型对瘦脂肪和肥胖脂肪组织中特定配体-受体相互作用的贡献。 有趣的是，我们发现配体和受体更倾向于来自不同细胞类型而不是相同细胞类型的相互作用，尽管随着肥胖而降低。 与其他细胞类型相比，在大多数 LR 对中，配体细胞类型和/或受体细胞类型是巨噬细胞的相互作用得分很高。 全局相互作用状态——通过取所有共定位 LR 对的相互作用状态评分的平均值得出——揭示了在 ND 中涉及 LR 信号传导的一组不同的细胞-细胞相互作用，这转变为对巨噬细胞 - 巨噬细胞和单核细胞 - 巨噬细胞之间的 LR 信号传导的growing preference 8w。

(B) Distribution of colocalized ligand-receptor (LR) pairs. Color intensity denotes the number of LR pairs colocalized at the tissue spot (normalized by the total number of tissue spots). (C) Percent of LR pairs that preferentially interact between adaptive and/or innate cell types. (D) Proportion of ligandreceptor interactions between single cells of the same cell type (intra-cell type) versus single cells of different cell types (inter-cell type) (E) Range of interaction scores across all colocalized LR pairs in all macrophageinvolved cell-cell pairs. Each LR pair’s interaction score between cell types is evaluated by computing the mean between the proportion of single cells of one cell type expressing the ligand and the proportion of single cells of another cell type expressing the receptor. (F) Number of LR pairs that preferentially interact between two cell types. Frequencies are normalized by the total number of colocalized LR pairs in the sample. Preferential interaction was determined by evaluating individual LR interaction scores based on the mean proportion of single cells in a cell type expressing the ligand and the mean proportion of single cells in a cell type expressing the receptor

Pre-crown-like structure neighborhoods appear in early obesity（早期肥胖中出现前冠状结构邻域）

冠状结构 (CLS) 出现在慢性肥胖的脂肪组织中，其中巨噬细胞在死亡或垂死的脂肪细胞周围积聚。 这里使用参与 CLS 形成的 Itgax 和 Trem2 以及载脂巨噬细胞的标志物 Cd9 来识别 8w 和 14w 组织切片中的 CLS，验证它们在 HFD 喂养时出现的已知趋势。 由于 CLS 不会在瘦脂肪组织中形成，所以在 ND 组织中单独筛选 Cd9 以确定可用作基线比较的组织spot。 然后，在每个 CLS 特征表达组织点周围划分了邻域，以捕获参与 CLS 动力学的周围细胞，并探索可以揭示肥胖期间 CLS 动力学关键属性的特征。

首先确定 CLS 邻域是否表现出差异表达。 比较了所有 ND 基线邻域中汇集的表达与 14 周时在每个单独 CLS 邻域内汇集的表达，发现 939 个基因是独特的（与对照邻域相比）并且显著差异表达（|log2FC| ≥ 1.5，p < 0.01）。 其中，24 个基因在至少 20% 的 CLS 邻域中差异表达。 此外，正如预期的那样，所有差异表达的基因都被上调，Trem2、Cd9 和 Itgax 是 CLS 区域中最常出现的 DEG。 此外，发现了几个与肿瘤进展相关的基因（Soat1、Hk3、Syngr1），这些基因与 CLS 形成有关。

然后，评估了 LR 与 CLS 出现的共定位趋势如何。发现，肥胖引起的 CLS 数量增加与 CLS 区域内 LR 共定位比例增加一致。具体来说，CLS 社区的 LR 共定位从 ND 的 18%（对照区域的 17%）增加到 14 周时的 58%（对照区域的 30%）。这些共定位的 LR 表现出多种动态模式，随着时间的推移，在 CLS 中变得更加丰富或耗尽，并在不同细胞类型之间相互作用。绝大多数 LR 对表明，它们 from the lean to obese states共定位的 CLS 社区比例总体上有所增加。其中大多数是 LR 对，从 ND 增加到 8w，然后从 8w 增加到 14w (54%)。有趣的是，有相当比例（20%）的 LR 对在 CLS 社区的参与从 ND 增加到 8w，然后从 8w 减少到 14w。之前在细胞内类型的组织贡献中观察到了这种类似的“放大 - 衰减”趋势，其中自然杀伤细胞和单核细胞在其各自的细胞类型网络中表现出增加的连接性，然后是连接性减弱。这种趋势推测在中间 HFD 喂食时间点的前 CLS 状态。

为了阐明负责在 CLS 邻域驱动动态信号的细胞类型，重新审视了在早期分析中发现主要表达每个 LR 对的细胞类型。在 ND 条件下，单核细胞和树突状细胞在基线邻域中主要表达大部分 LR 对。到 14 周时，巨噬细胞占 CLS 生态位中受体 (77%) 分泌和吸收的大部分配体 (60.7%)。进一步检查了增加组中的特定 LR 对，筛选仅在 HFD 喂养后出现在 CLS 社区的 LR 对。确定了 12 个 LR 对，它们在瘦脂肪组织中没有基线邻域共定位，然后在肥胖脂肪组织中的这些部位显著出现。在剩余的 LR 对中，一些涉及配体和/或受体，该配体和/或受体在肥胖中具有先前特征性的作用，如 C3，与脂质代谢和肥胖期间脂肪组织炎症的贡献有关。在该组中，C3 是一种复发的、主要是单核细胞表达的配体，从 ND 到 14 周，与 CLS 邻域的受体共定位的平均百分比增加了 54.8%。 C3 与受体 Itgax、Itgb2、C3ar1 和 Lrp1 相关，这些受体在 8w 时由数据中的先天细胞类型混合表达。在 14 周时，C3 仅与巨噬细胞相关的受体共定位。几个 LR 对表现出类似的行为。

Emergence of Crown-like Structures

• 图注：(A) H&E staining of the 14w adipose tissue section showing a characteristic crown-like structure (CLS). (B) Identification of CLSs in the ST data. In HFD settings, tissue spots were classified as CLSs if they expressed Cd9 with either Itgax or Trem2. As CLSs are not found in lean adipose tissue, only the more general lipid-laden macrophage marker, Cd9, was queried in the ND setting. (C) Illustration of CLS neighborhood demarcation. Spots within two outdegrees of the CLS-classified spot (landmark) were defined as the CLS neighborhood. Following analyses evaluated different features relative to these neighborhoods. (D) Differentially expressed genes (|log2FC| ≥ 1.5, p < 0.01) found in at least 20% of CLS neighborhoods. Color intensity indicates fold change between ND and 14w. Red values indicate an increase in expression (positive FC) and blue indicates a decrease in expression (negative FC). (E) LR pairs in CLS neighborhoods. Red neighborhoods correspond to CLSs while blue neighborhoods correspond to a control population containing housekeeping gene Ppia. The transparency of the filled-in neighborhoods indicates the number of colocalized LR pairs found in the neighborhood, with more opaque shading corresponding to a higher number of colocalized pairs. For visual clarity, neighborhoods are shown to an outdegree of 1, but analyses were performed on neighborhoods with an outdegree of 2. (F) Patterns of LR colocalization dynamics at CLS neighborhoods. The majority of LRs increased in colocalization at CLSs from ND to 8w and 8w to 14w (orange-orange block). The second most frequent pattern observed was LRs that increased in colocalization at CLSs from ND to 8w, then decreased from 8w to 14w (orange-light blue block).

Discussion

炎症是肥胖脂肪组织的一个突出特征，它有助于胰岛素抵抗的发展。 在这里，在其空间背景下对免疫细胞特征的研究突出了先天和骨髓细胞群扩张的组织范围。 虽然 scRNA-seq 数据改进了细胞身份的推断，但探索具有更高分辨率的基于测序的空间转录组学平台将是有价值的。

频繁的相互作用与肥胖症中的单核细胞浸润和分化成巨噬细胞一致，并进一步得到单核细胞对组织功能贡献增加的支持。空间模式分析显示所有免疫细胞类型的异质性增加。这一发现与肥胖症免疫细胞中采用额外的极化状态或表型一致，例如肥胖症中富含 Cd9 的巨噬细胞。其他免疫细胞中出现的亚型不太容易识别，可能是由于这些细胞类型中不同功能状态的可能性较低。已知的亚型转变包括肥胖中 Cd8+ T 效应细胞和 Cd4+ TH1 细胞增加以及调节性 T 细胞减少。此外，虽然在肥胖小鼠内脏脂肪组织中观察到 IgG+ B 细胞增加，但我们的 B 细胞亚群中唯一差异表达的基因是免疫球蛋白基因 Ighg3，它在高脂饮食环境中富集（log2FC 为 1 ）。

与在适应性细胞或先天性和适应性细胞的组合中表达的配体和受体相比，在先天性细胞中表达的配体和受体优先在肥胖组织中共定位。 这些相互作用主要来自单核细胞和 ATM，这与它们在肥胖中的数量增加一致。 对图灵系统的细胞内和细胞间动力学的适应同样表明单核细胞和 ATM 对肥胖组织功能的贡献增加，而适应性免疫细胞、NK 细胞和 ATDC 的贡献减少。

未来的工作将染色冠状结构生物标志物以确认它们的存在，尽管 CLS 形成标志物的共定位以及与肿瘤浸润细胞类型相关的基因特征增加等特性为它们在我们的样本中出现提供了初步的信心。 此外，虽然不能肯定地说报告的细胞类型相互作用解释了在这些组织标志处观察到的配体-受体活性，或者排除脂肪细胞和其他非免疫细胞类型的参与，但我们的数据捕获了主要的免疫细胞类型 参与 HFD 喂养过程中的共定位配体受体表达。 大量 CLS 与肥胖和癌症等相关疾病的更严重临床结果有关。 进一步评估和验证在本研究中观察到的趋势有助于揭示早期肥胖中 CLS 的启动机制和治疗靶点。

这项研究为预测疾病中组织状态的轨迹提供了概念验证。 我们的疾病中破坏组织形态发生的模型可以推广到其他组织，以定义一个疾病指数，该指数将健康与预测代谢功能障碍或其他疾病的破坏组织状态区分开来。 与肥胖相关的是肝脏和肠道组织，它们已经确定了肥胖中基因表达的组织变化。 对这些组织中空间和单细胞转录组学的综合分析可以让我们建立一个一致的肥胖组织间指数。

Some obesity-related changes in adipose tissue immune cells persist even in weight loss, highlighting the need to better understand mechanisms that promote adipose tissue dysfunction. These mechanisms could also tie obesity to the risk for other conditions, including cardiovascular disease and cancer, with one study finding that metabolically activated macrophages in mammary adipose tissue promotes triple-negative breast cancer. Future studies using time course spatial transcriptomics could be particularly powerful in understanding tissue dynamics and the evolution of cell-cell communication in adipose tissue

Methods（关注一下重点方法）

数据分析

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Integration of Spatial and Single-Cell Transcriptomics Data（单细胞空间联合）

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Modeling Tissue Function

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Ligand-Receptor Analysis

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Tissue Landmark Analysis（地标分析）

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