1. Author
Robert A. Lamb是西北大学分子生物科学系教授、西北大学医学院微生物学免疫学教授和霍华德休斯医学研究所研究员。他在英国伯明翰大学获得了生物化学学士学位，在剑桥大学获得了博士和理学博士学位。他来到美国，在洛克菲勒大学与Purnell Choppin做博士后工作，后来在加入西北大学之前，他成为了那里的一名教员。他的荣誉包括连续获得美国国立卫生研究院MERIT奖。他曾任美国病毒学学会主席。兰姆博士是美国国家科学院院士和美国艺术与科学院院士。
2. Background
2.1 副流感病毒
副粘病毒是膜包膜的负义单链 RNA 病毒，能够引起多种人畜共患疾病，他们利用两种表面糖蛋白——血凝素神经氨酸酶蛋白（HN）与融合蛋白（F）来介导病毒感染宿主。血凝素负责与唾液酸结合进而进入宿主细胞体内；神经氨酸酶负责水解唾液酸，主要参与病毒出胞的过程。此外，与受体结合后会诱导 HN 的构象变化，随后触发F蛋白发生折叠，进而介导病毒和靶细胞膜的融合。
HN是一种寡聚 II 型跨膜蛋白，具有短胞质结构域和大胞外域。胞外域包含长螺旋柄和具有酶功能的大球状头结构域（NA 结构域）。HN-茎残基决定 F 特异性和激活。然而，F/HN 相互作用以及受体结合调节 F 蛋白激活的机制尚不清楚。最近，新城疫病毒（NDV）HN胞外域的结构显示出头部（NA结构域）呈“头朝下”构象，其中两个头部与茎的两侧形成对称的相互作用。该界面包括与激活F蛋白的茎，并且头部在空间上屏蔽这些残基不与 F 相互作用。
2.2 X射线晶体衍射技术
X射线晶体学的研究步骤如下：蛋白或DNA样品纯化——结晶——衍射、数据收集——确定蛋白结构（衍射数据→数据处理→相位解析→建模→模型修正→模型检验）——理解结构与功能的相互关系
衍射数据收集
在获得晶体之后，就要做衍射数据收集，即用X射线打到晶体上，产生衍射，并记录衍射数据。X射线的来源主要有两种，一种是在常用X射线仪上使用的，通过高能电子流轰击铜靶（或钼靶），产生多个特征波长的X射线；另一种就是利用同步辐射所产生的X射线，其波长可以变化。上海光源就是利用同步辐射产生X射线，特点是光源强度更高，分辨率更好。
数据分析
对记录到的衍射数据进行分析，可以获得晶体所属的晶系和对应的布拉维格子以及每个衍射点在倒易空间上的miller指标和对应的强度。
晶体结构解析
由于晶体衍射实际上是晶体中每个原子的电子密度对X射线的衍射的叠加，衍射数据反映的是电子密度进行傅立叶变换的结果，用结构因子来表示。通过对结构因子进行反傅立叶变换，就可以获得晶体中电子密度的分布。而结构因子是与波动方程相关的，计算结构因子需要获得波动方程中的三个参数，即波的振幅、频率和相位。振幅可以通过每个衍射点的强度直接计算获得，频率也是已知的，但相位无法从衍射数据中直接获得，因此就产生了晶体结构解析中的“相位问题（phase problem）”。
晶体结构解析中所采用的解决相位问题的方法有直接法和Patterson法。而对于解析生物大分子结构的主要方法有分子置换法、同晶置换法和反常散射法。
确定相位
分子置换法
如果一个待测的蛋白质分子其同源蛋白的分子结构是已知的，则在解决它的衍射相位问题时，常用分子置换法。分子置换法的优点是不必制备重原子衍生物，只要收集一套衍射数据就可以了。适用条件：目标蛋白A有同源蛋白结构B，同源性30%以上。
多重同晶置换（MIR）
把对X射线散射能力大的重金属原子作为标识原子。这种置换入重原子的大分子应与无重原子时的原晶体有相同的晶胞参数和空间群，且绝大多数原子的位置相同，故称同晶置换。从这些含重原子晶体的衍射数据，利用基于派特逊法的方法可解出重原子的位置，据此算出其结构因子和相角，进而利用相角关系计算出没有重原子的原晶体的相角，解出结构。经常使用不只一种重原子进行置换，以得几种同晶置换衍生物, 称多对同晶置换法。
多波长反常散射（MAD）
晶体衍射中有一条弗里德耳定律, 就是说不论晶体中是否存在对称中心,在晶体衍射中总存在着对称中心,也即有FHKL=FHKL。但是当使用的X射线波长与待测样品中某一元素的吸收边靠近时,就不遵从上述定律,也即FHKL≠FHKL。这是由电子的反常散射造成的, 利用这一现象可以解决待测物的相角问题。一般, 这一方法常与重原子同晶置换法结合使用。在收得同晶置换物的衍射数据后, 改变入射线波长至靠近重原子的吸收边处，再次收集数据，这套数据是存在反常散射的,可利用这两套数据来求位相。有如多同晶置换法,如采用几个不同波长的X射线,对所含不同元素收集几套反常散射数据,则可得更正确、更完整的相位信息,是为多波长反常衍射法(MAD）。
两者的相同点：都是利用重原子的特性来解决相角问题。
两者的差别：MAD是基于MIR的基础之上的，采用多种波长完备所需的信息。
在没有同源蛋白结构报道的情况下，或者分子置換法不能解決的结构，一般是用硒代蛋白来解决初始相位的问题（重金属置换有时候难度太大），即在蛋白表达过程中在培养基中加入硒代甲硫氨酸来替代通常的甲硫氨酸，因此表达出来的蛋白的甲硫氨酸全部取代为硒代甲硫氨酸。硒代蛋白重新结晶后，收集衍射数据，确定相位。
3. Methods
1. 抗原抗体的纯化表达
2. 流式细胞术
3. 细胞融合实验
4. 荧光报告实验
5. X射线晶体衍射技术
4. Results
实验团队通过分子置换的X射线晶体衍射技术，发现与NDV病毒不同的是，副流感病毒存在2“up”2“down”的构象，同时up/down构象之间通过二硫键相互作用。Up与down之间也会形成DOD（dimer to dimer）的作用界面。该界面高度疏水，且两界面的大小不一。在后续的突变验证中也证明了该界面的重要性。进一步解析副流感病毒胞外结构域结构时发现：茎部的V81/L85，头部的D398，DOD2界面中的H188对于茎-头的相互作用起着至关重要的作用。
5. Discussion
作者：Brett D. Welch
通讯作者：Robert A. Lamb
单位：Department of Molecular Biosciences, Northwestern University,Evanston, Illinois, United States of America
年份：2013.08.08
期刊：PLOS PATHOGENS
科学问题 ：副流感病毒的HN蛋白是如何通过胞外结构域与F蛋白发生相互作用，进而诱导融合？
结论：实验团队察到PIV5 HN蛋白可以采用由2个头朝下和2个头朝上组成的混合构象，这种混合构象状态表明，PIV5 HN 四聚体在头区二聚体-二聚体中具有固有的灵活性和不对称性的潜力。同时也验证了唾液酸受体结合可以改变头域二聚体构象、暴露茎区以进行 F 结合和激活。 进一步结构解析发现：暴露一个茎位点可能导致 F 激活，或者暴露两个茎位点但不完全形成 4-heads-up 构象足以激活 F。H188 的独特构象表明它在受体水解或促进结合模式中发挥作用。
