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Dynamic blood single-cell immune responses in patients with COVID-19.

影响因子：13.493

PMID：33677468

期刊年卷：Signal Transduct Target Ther 2021 03 06;6(1)

DOI：10.1038/s41392-021-00526-2

摘要

由 SARS-CoV-2 病毒引起的 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 爆发是持续的全球卫生紧急情况。但是，该病毒的发病机制尚不清楚，并且无法治愈该疾病。-疾病描述

我们通过使用 5' 基因表达、T 细胞受体 (TCR) 和 B 细胞受体 (BCR) V(D)J 转录组分析，研究了 COVID-19 患者不同阶段血液免疫反应的动态变化。我们从 16 名 COVID-19 患者的 25 个样本中获得了 341,420 个外周血单核细胞 (PBMC) 和 185,430 个克隆型 T 细胞和 28,802 个克隆型 B 细胞的单细胞 mRNA 测序 (scRNA-seq) 数据，用于动态研究。此外，我们使用了三个对照样品。-方法

我们发现树突状细胞 (DC)、CD14+ 单核细胞、和巨核细胞祖细胞 (MP)/血小板以及 COVID-19 患者的幼稚 CD4+ T 淋巴细胞减少，以及危重患者的 CD8+ T 淋巴细胞和自然杀伤细胞 (NK) 显著减少。-结果1

I型干扰素（IFN-I）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和铁死亡途径在疾病活动期间被激活，并在患者病情好转后逐渐恢复。

与这一发现一致，IFN-I 信号诱导基因的 mRNA 水平 并在病情好转后逐渐恢复。IFN-I 信号诱导基因IFI27的 mRNA 水平在患者COVID-19验证队列显著增加，其中包括38名患者和35个对照对照组比较。-验证1

在 215 名 COVID-19 患者和 106 名对照者的额外队列中，与对照者相比，COVID-19 患者****血清中干扰素-α（IFN-α）的浓度显著增加****，进一步表明了COVID-19免疫反应中的IFN-I通路。TCR 和 BCR 序列分析表明，COVID-19 患者对 SARS-CoV-2 抗原产生了特异性免疫反应。-验证2

我们的研究揭示了人类血液对 SARS-CoV-2 感染的免疫反应的动态格局，为治疗 COVID-19 的治疗潜力提供了线索。-结论

PBMC 的单细胞转录组

从全血中分离出每个个体的外周血单个核细胞 (PBMC)，并在 10X 基因组学平台上使用 Chromium Next GEM Single-Cell V(D)J Reagent Kits v1.2 对 PBMC 进行 scRNA-seq 分析（图1a）。从 19人19 个样本中获得了 241,292 个 PBMC 细胞、131,391 个 TCR 克隆和 23,674 个 BCR 克隆，其中包括 16 名 COVID-19 患者和 3 名对照。PCA和 t-SNE表明，标准化后 19 个样本之间没有批次效应（图 1b）。在这些样本中，我们确定了 8 种完全不同的 PBMC 细胞类型，根据使用 Seurat V3 R 包以 0.9 分辨率的聚类结果，可以将其进一步分为 30 个细胞亚型（簇）（图 1c, d）。

8个PBMC的细胞类型包括

CD4 + T淋巴细胞通过识别CD4，

CD8 + T淋巴细胞通过识别CD8A，

CD16 +由识别单核细胞FCGR3A，

CD14 +单核细胞通过识别CD14通过鉴定，

自然杀伤细胞（NK可以）KLRF1通过鉴定，

B细胞MS4A1，

树突状细胞（DCS）通过识别FCER1A通过识别和

巨核细胞祖细胞/血小板（MP /血小板）PF4（图（图1c）。部分样品中标记基因的 t-SNE 表达图显示在补充图S1 中。30 种细胞亚型的详细信息如图 1 所示。

图1d包括7种CD4+ T淋巴细胞亚型、6种CD8+ T淋巴细胞亚型、4种B淋巴细胞亚型以及其他细胞亚型。

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图1COVID-19 患者和对照组 PBMC 的细胞组成。

a用于 scRNA 测序的样本和研究设计简要总结。样品的详细信息见表S1。

b COVID-19 患者与正常对照的整合分析结果显示主成分 (PC) 和 TSNE 算法可视化。样品之间没有观察到批次效应。

c由已知细胞标记物鉴定的8种主要 PBMC 细胞类型。

d COVID-19 患者与正常对照的整合分析结果显示主成分（PC）、TSNE 和 UMAP 可视化。总共在 PBMC 中鉴定了 30 种细胞亚型。

e将每个患者与正常对照进行比较的 PBMC 的主要细胞类型组成的比率的组成。计算每个样品中每种细胞类型的比例，然后比较病例和对照之间每种细胞类型的比例（对于对照样品，使用三个对照样品的平均比例进行比较）。

f每个细胞亚型的前 30 个基因的基因表达热图。

g PBMC 的所有 30 种细胞亚型组成的比率组成，将每位患者与正常对照进行比较。计算每个样本中各细胞亚型的比例，然后比较各细胞亚型在病例和对照之间的比例（对照样品以三个对照样品的平均比例进行比较）

COVID-19患者与对照组PBMC细胞亚型比例的比较

大多数 COVID-19 患者的髓系 DC、CD14+ 单核细胞和 MP/血小板扩增，而超过一半的 COVID-19 患者的 CD16+ 单核细胞和 NK 减少****（图1e****）。

naïve CD4+ T 淋巴细胞亚型核糖体编码基因（如*****RPL32、RPL30、RPS12*****和*****RPS3A*****）为标志的（簇 1）在所有住院患者中均降低。鉴于核糖体编码基因在病毒 RNA 转录和复制中起关键作用（CL：14985，在 STRING 数据库中），核糖体编码基因在naïve CD4+ T 淋巴细胞中的高表达可能与病毒的复制有关。

naïve CD8+ T（簇 4，高表达的非编码 RNA LINC02446，EEF1A1和EEF1B2）和 NKs（簇 13，高表达胱抑素超家族基因CST7、杀伤细胞凝集素样受体KLRD1和KLRG1也被发现在超过一半的患者中减少。

效应记忆CD8 T（簇23，高度表达STMN1，HMGB2，TUBA1B，HIST1H4C），CD14 +单核细胞（簇10，高度表达FCN1，LYZ，S100A8，簇12，高度表达S100A12，S100A6、TYROBP和簇 16，高表达CAMP、LCN2、CCL3和CCL3L1）、naïve B 细胞（簇 19，高表达*****CD74*****、*****CD79A*****和*****HLA-DRA*****）、髓系 DC（簇 21，高表达*****HLA-DRB5、HLA-DPB1*****和*****HLA-DQA1*****）和** MP/血小板（簇11，高表达的*****CAVIN2*****、*****HIST1H2AC*****和*****TUBB1*****和簇 28，高表达的*****HIST1H4H*****、*****HIST1H3H*****、*****H3F3A*****和*****NT5C3A*****）在超过一半的患者中增加。**每个簇中前 30 个基因的基因表达热图如图1f所示。

终末 CD8+ 效应细胞耗竭与疾病危急状态有关（图 2a、b中的红色箭头）。与其他条件相比，温和组呈现出更高的naïve B 细胞比例（图 2a、b 中的绿色箭头）。这些结果表明，终末 CD8+ 效应 T 细胞耗竭可能与处于危急状态的患者有关，并且大部分用于产生抗体的naïve B 细胞扩增可能会阻止 COVID-19 恶化。

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图2SARS-CoV-2 感染的五个细胞簇的 UMAP 预测和 IFN-I 和 MAPK 通路的基因表达变化。

a危急 ( n = 2)、重度 ( n = 1)、中度 ( n = 6)、轻度 ( n = 3)、治愈 ( n = 4) 和对照 ( n = 3)之间的五个细胞簇的UMAP 投影. 红色箭头效应CD8 + T（CTL）的，绿色箭头B细胞。与 COVID-19 患者和对照组相比，它们发生了显著变化。

b统计显著性（每个其他条件与对照比较），用于在所述的细胞群。

c危重患者（患者 1 和患者 2）与正常对照。

d重症患者（患者 3）与正常对照。

e中度患者（患者 4-9）与正常对照，以及f治愈患者（患者 11 和 10）与正常对照。

g – j 分别在危重 ( g )、重度 ( h )、中度 ( i ) 和治愈的 COVID-19 患者与正常对照 ( j )中 MAPK 目标的 UMI 计数的 Log2 倍变化。每个点代表不同的细胞亚型

COVID-19 患者和对照组之间的差异表达途径

通过STRING网络分析，发现除了呼吸和氧化磷酸化等基本代谢信号通路外，显著富集的信号通路主要参与了5条通路的过度激活（图 2c-j，补充图S3 –S7)：

(1) 病毒基因组复制和感染（病毒 mRNA 翻译、肽链延长和 SRP 依赖性共翻译靶向膜蛋白，在 CD14+ 单核细胞、naïve CD4+ T 细胞和其他细胞中高度表达）；

(2)I型干扰素信号（IFN-I）（在naïveB细胞和CD14+单核细胞中高表达）；

(3)丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）（还包括AP-1、Jun和bZIP Maf转录因子）（在naïveB细胞、CD8+ T细胞和NKs中高表达）；

(4)淋巴样和非淋巴样细胞之间的免疫学相互作用（在终末CD8+效应T细胞和naïveB细胞中高度表达）；

(5) 主要组织相容性复合体 (MHC) II 类蛋白质复合体（在 B 细胞中高度表达）****2c-j****，补充图****S8-S9****）。

然而，在治愈患者中MAPK通路基因的表达下调，表明MAPK通路基因的表达降低是患者康复的好兆头（图****2j****）。

COVID-19患者病情改善前后配对比较

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图 3危重病人1改善前后动态研究。动态研究中确定的细胞类型

aTSNE 图（P1-1、P1-2、P1-3、P2-1、P2-2、m P2-3、P3-1、P3-2、P6-1、 P6-2、P7-1、P7-2、P9-1、P9-2、P10-1 和 P10-2）。

b P1-1（临界状态）和P1-2（改善状态）的TSNE图，显示了两个样品中的细胞类型分布。c P1-2 和 P1-3（固化条件下）的 TSNE 图，显示了两个样品中的细胞类型分布。

d P1-1、P1-2和P1-3所有细胞亚型的比较。

eP1-1 和 P1-2 之间与病毒 mRNA 翻译、IFN-1、MAPK 靶标和铁死亡有关的基因的 UMI 计数的 Log2 倍变化。每个点代表不同的细胞亚型。

f在 P1-2 和 P1-3 之间，参与病毒 mRNA 翻译、IFN-1、MAPK 靶标和铁死亡的基因的 UMI 计数的 Log2 倍变化。每个点代表不同的细胞亚型

与改善阶段相比，包括病毒 mRNA 翻译、IFN-I 和 MAPK 在内的途径在关键阶段显著上调（图 ****3e****）。KEGG 分析显示，与改善阶段相比，一种受调节的细胞死亡形式——铁死亡——在疾病关键阶段显著上调（图 ****3e****，补充图****S13****）。与治愈阶段相比，包括病毒 mRNA 翻译、IFN-I 和 MAPK 在内的途径在改善阶段也上调（图 3f，补充图S14- S15 )。铁死亡涉及的基因表达谱在改善期和治愈期之间没有显著变化，表明铁死亡主要发生在关键阶段，并在改善阶段逐渐恢复正常（图3f）。在比较危重、改善和治愈阶段时，在另一名危重患者 - 患者 2 中发现了类似的细胞类型和亚型、途径和基因表达模式的变化（补充图S16- S 20）。

与第一轮分析中的正常对照相比，症状严重的患者3显示淋巴细胞扩增；他的淋巴细胞扩增在治愈阶段减少（图4a、b）。与治愈阶段相比，包括病毒 mRNA 翻译、IFN-I 和 MAPK 在内的途径在严重阶段显著上调（图4c）。然而，ferroptosis 信号通路在疾病严重阶段只是略微上调（补充图S21- S 22），这可能是因为他的淋巴细胞细胞的扩张。对于三名 COVID-19 中度患者——患者 6、7 和 9——与治愈阶段相比，IFN-I 和 MAPK 通路在疾病阶段均显著上调（图4d-f，补充图S23- S 30 )。与患者 6 和 7 的治愈阶段相比，病毒 mRNA 翻译和铁死亡途径在疾病阶段显著上调。然而，与治愈阶段相比，疾病阶段病毒 mRNA 翻译和铁死亡没有显著上调。患者 9，这可能是由于她相对较高的 T 和 B 细胞扩增（补充图S27- S 29）。病情较轻的患者——患者 10——表现出轻度的免疫反应。

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图 4重症患者3和中度患者6的疾病和治愈情况的动态研究。

在对 P3-1（严重疾病）和 P3-2（治愈疾病）进行动态研究的患者中鉴定的细胞类型TSNE 图。

b P3-1和P3-2所有细胞亚型的比较。

c P3-1 和 P3-2 之间病毒 mRNA 翻译、IFN-1 和 MAPK 靶标基因的 UMI 计数的 Log2 倍数变化。每个点代表不同的细胞亚型。对于对照组，仅绘制 DE 基因（FDR < 0.05）。细胞亚型如图 1 所示。

d对 P6-1 和 P6-2 进行动态研究的患者中鉴定的细胞类型的 TSNE 图，显示了两种状态下的细胞类型分布。

e P6-1 和 P6-2 的所有细胞亚型的比较。f与病毒 mRNA 翻译、IFN-1、MAPK 靶标和 P6-1 和 P6-2 之间的铁死亡有关的基因的 UMI 计数的 Log2 倍变化。每个点代表不同的细胞亚型。对于对照组，仅绘制 DE 基因（FDR < 0.05）。细胞亚型如图 1 所示。

COVID-19 患者的 TCR 和 BCR 扩增

从 19 名参与者获得的 28 个样本中检测到 185,430 个克隆型 T 细胞和 28,802 个克隆型 B 细胞。

COVID-19 患者和对照患者的库显示每个人的克隆型 T 细胞和 B 细胞存在很大差异。

每个患者的克隆型 T 细胞分布如图 5a（补充表S7）。

通过比较7例患者病情好转前后的克隆型T细胞，我们发现患者的克隆型T细胞的相对数量从疾病到痊愈呈下降趋势（图5b）。

然而，在危急情况下（患者 1-1 和患者 2-1）检测到较低的克隆型细胞，这可能是由于该疾病阶段的淋巴细胞耗竭所致。在中度患者 9 中检测到最高相对数量的克隆型 T 细胞（图5a、b)，这可能是由于她的淋巴细胞的扩张。

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图 5T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞 V(D)J 克隆扩增和 COVID-19 患者 5'mRNA、T 细胞受体 (TCR) 和 B 细胞受体 (BCR) 综合分析的 TSNE 图。

a V(D)J 在每位患者中检测到的 T 细胞克隆数

b患者 1、2、3、6、7、9、10 的疾病状况和康复情况检测到的 T 细胞克隆数

c V(D)J 在每个患者中检测到的 B 细胞克隆数。d在患者1，2，3，6，7，9疾病和恢复条件的B细胞克隆的数量进行检测，10。

È克隆在每个患者相关的IgH序列

F不同 COVID-19 患者 IgH 基因可变区的突变数量。统计显著性是指对同一患者不同病程的动态分析数据进行统计。* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001；t检验。

g住院患者的克隆型 T 细胞

h治愈患者的克隆型 T 细胞

i住院患者的克隆型 B 细胞

j治愈患者的克隆型 B 细胞

住院患者：P1-1、P1-2、P2-1、P2-2、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1、P10-1。治愈患者：P1-3、P2-3、P3-2、P6-2、P7-2、P9-2、P10-2。这些患者的详细细胞类型如图 1 所示。

k克隆型 T 细胞（末端效应 CD8 T 细胞）的 TSNE 图：CVVNYYKAAGNKLTF_CASSSLGSAPRELFF（TRAV12-101、TRAJ1701 和 P2-1、P2-2 和 P2-3 中的 TRAC*010）

与克隆型 T 细胞相比，检测到的克隆型 B 细胞的总数要低得多（图****5c, d****, 补充表****S8**** )。患者总克隆型 B 细胞的相对数量随着病情的改善而增加（图 ****5d****）。

免疫球蛋白 (Ig) 基因的 V(D)J 片段以有序的方式重新排列，以在 B 细胞发育过程中与抗原相遇之前产生主要的 Ig 库；

在免疫反应过程中，活化的 B 细胞在生发中心内进行克隆扩增，Ig 基因的可变区可以进一步突变以产生高亲和力的抗体。

详细分析表明，几乎所有这些 COVID-19 患者都产生了与克隆相关的 IgH 基因（图5e）。所有患者的 IgH 基因的可变区均高度突变，每个基因平均有 9.39 个核苷酸（图 5f）。

通过在 5' 基因表达文库 scRNA 的 TSNE 图中绘制克隆型 T 细胞和克隆型 B 细胞，进一步对 5' 基因表达文库、T 细胞受体 (TCR) 和 B 细胞受体 (BCR) 数据进行了综合分析数据（图3a) 比较住院条件下相同患者的TCR和BCR扩增条件。住院条件下的克隆型 T 细胞主要是终末 CD8 + 效应 T 细胞（图****5g****); 在治愈条件下，除终末CD8+效应T细胞外，还检测到Th1/Th17/Tregs中的高频克隆型T细胞（图****5h，****红色箭头）。

对于克隆型 B 细胞，在这些患者的住院条件下未发现过度高频扩增（图 5i）。然而，在这些患者的治愈情况下，可以在naïveB细胞中检测到高频克隆型B细胞（图5j， 红色箭头）。

这些结果呈现了 T 和 B 淋巴细胞的细胞扩增动态景观。

COVID-19患者随着病情好转表现出不同程度的特异性记忆T细胞扩增或保存。使用 scRNA-seq 数据，我们可以识别不同疾病条件下记忆克隆型 T 细胞中的抗原受体序列。

具有以下TCR可变序列的克隆型效应记忆CD8 T细胞在疾病的不同阶段在危重患者2中显著增加。

(1) CVVNYYKAAGNKLTF_CASSSLGSAPRELFF (TRAV12-101, TRAJ1701 和 TRAC*01) 在 P2-1（关键）中有 11 个克隆，在 P2-2（改进）中有 88 个克隆（FDR = 5.99 × 10 -4 , P2- 1 vs. P2-2，调整二项式概率，下同），P2-3（治愈）222个克隆（FDR = 9.48 × 10 -39，P2-2 vs. P2-3）（图5k）。这些克隆从终末效应 CD8 T 细胞转变为效应记忆 CD8 T 细胞，从疾病状态到治愈状态（图 5k）。

(2) CAMKTSYDKVIF_CASTPGDTIYF (TRAV12-301, TRAJ5001, TRAC*01)在P2-1中有6个克隆，在P2-2中有23个克隆（FDR = 3.92 × 10 -5，P2-1 vs. P2-2 )，以及 P2-3 中的 50 个克隆（FDR = 8.32 × 10 -6，P2-2 vs. P2-3）。

(3) CAFRKDTGRRALTF_CASSPQGGGGYTF (TRAV2401, TRAJ501, TRAC*01)在P2-1中有4个克隆，在P2-2中有12个克隆（FDR = 9.75 × 10 -4，P2-1 vs. P2-2），和 P2-3 中的 24 个克隆（FDR = 0.01，P2-2 与 P2-3）。这些克隆型细胞的扩增和保存可能与患者对 SARS-CoV-2 抗原的记忆有关。

通过分析在疾病过程中发生变化的 Ig 编码基因，我们发现变化最大的基因属于 IGHV3 家族（IGHV3-21、IGHV3-22、IGHV3-30、IGHV3-48、IGHV3-49、IGHV3-72， 等等）。其他家族，如IGKV1、IGKV3、IGLV2、IGLV3、IGLV1和IGHV4，在不同的疾病条件下也发生了很大的变化（图S31a）。这些样品的 IgG 和 IgM 值显示在补充图S31b 中. 在最近治愈的情况下，患者具有比正常对照更多的 Ig 基因（补充图S32）。总之，参与 B 细胞抗体产生的适应性免疫可能在对抗 SARS-COV-2 中发挥关键作用。

IFN-I和MAPK信号的实验检测

从 scRNA-seq 分析中，参与 IFN-I、MAPK 通路的基因在 COVID-19 患者中稳定上调。为了进一步验证这一发现(real-time RT-PCR) 检测另一组 38 名 COVID-19 患者中相关基因的表达，其中包括 3 名重症、3重症患者、19 名中度患者、3 名轻度患者和 10 名治愈的 COVID-19 患者和 35 名正常对照组（图 6a）。IFI27cRNA-seq 数据中 COVID-19 患者中最强的上调基因。与正常对照组相比，重症患者上调8.1倍，重症患者51.7倍，中度患者39.9倍，轻症患者38.6倍，治愈患者29.5倍（图6a）。免疫荧光染色显示IFI27在 COVID-19 患者的淋巴细胞中高表达，但在对照组的淋巴细胞中仅部分表达（图6b、c）。与对照组相比，IFN-I 通路中的另一个基因BST2在 COVID-19 患者中也显示出上调（图 6a）。这些结果表明IFI27和BST2是 SARS-CoV-2 感染的候选标记基因。FOS是一种介导 MAPK 途径的转录因子，在 COVID-19 患者中显示出显著上调，但在康复患者中通过实时 RT-PCR 分析显示出明显下调（图 6a）。这表明FOS是 COVID-19 患者康复的候选标志物。

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图 6IFN-I信号的实验验证。

a干扰素途径中的IFI27和BST2以及MAPK 途径中的FOS的实时 PCR 验证。IFI27和BST2在 COVID-19 患者中上调。FOS被上调在住院患者但是在治愈的患者（下调Ñ = 3为关键，Ñ = 3严重，Ñ 中度= 19，Ñ = 3温和，Ñ = 10用于固化患者COVID-19和35正常控制）。* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001; 学生t检验。

b比较 COVID-19 和正常对照的 IFI27 免疫荧光信号的统计显著性。* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001。

c COVID-19 患者和正常对照的 PBMC中IFI27 的免疫荧光染色。

d ELISA检测的257例COVID-19和106例匹配的COVID-19患者血清中IFN-α浓度，包括重症和危重症组（12.02 ug/mL ± 2.80，N = 68）、中度组（23.99 g/mL ± 4.840，N = 133 例）、轻度组（20.29 ug/mL ± 7.732，N = 34 例）和治愈组（9.637 ug/mL ± 1.184，N = 22 名患者）。* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001；单向方差分析

ELISA进一步测量了 257 名 COVID-19 患者和 106 名匹配对照者血清中的总 IFN-α 浓度。将患者分为四组：重症组、中度组、轻度组和治愈组。我们发现患者的总 IFN-α 水平显著高于对照组（p < 0.001, 17.79 ug/mL ± 2.55 vs. 6.42 ug/mL ± 0.703）。中度组（p < 0.001，23.99 ug/mL ± 4.840，N = 133 名患者）和轻度（p < 0.001，20.29 ug/mL ± 7.732，N = 34 名患者）患者的IFN-α 显著增加（图 6d）。重症组和重症组血清中IFN-α浓度为12.02 ug/mL ± 2.80 ( N = 68) ，治愈组为9.637 ug/mL ± 1.184 ( N = 22, p < 0.05,)（图6d）。这一结果表明，中度患者产生的 IFN-α 水平最高.

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