10X Genomics Visium空间转录组小试牛刀

编辑：陆瑶

校对：ANIMUS

编者按：脑科学是全球科研的前沿领域，是大国竞争的“关键领域”。

脑科学依然有太多重大问题有待回答，比如：

认知是如何形成的？

灵魂是否存在？

人为什么会做梦？

人比黑猩猩少1对染色体，基因相似度72%，剩下28%的差异碱基序列何以决定认知与智慧的差异？

脑组织这一团细胞，是如何产生思想的？

上升到哲学层面，物质如何决定意识？

……

直到今天，大脑依然是人类认知的“黑洞”。科学界有人将脑科学称为“人类科学最后的前沿”。

爱丽慕斯学术团队专注于生命科学和医学前沿进展，探索心脑血管疾病和癌症的致病基因、发病机制和药物开发等，尤其是脑科学。作为本刊【Amazing brain】系列第二篇，这里解读应用10X Genomics Visium空间转录组技术，研究阿尔兹海默症相关基因的时间空间表达谱的文章，助力脑科学前沿进展共享。

目前，阿尔茨海默病（AD）研究的核心问题之一是Aβ沉积与神经退行性变的关系。既往研究观察到淀粉样斑块周围的炎性样改变，但对于这一过程中的分子机制和细胞间相互作用依旧所知甚少。2020年8月由比利时鲁汶VIB大脑与疾病研究中心Mark Fiers和Bart De Strooper和瑞典皇家理工学院Joakim Lundeberg等人在CELL上发表题为“Spatial Transcriptomics andIn SituSequencing to Study Alzheimer's Disease.”的文章，结合空间转录组（ST）和原位测序技术（ISS），绘制了AD发生发展过程中的时间和空间基因表达图谱，进一步揭秘由Aβ沉积诱发的一系列AD相关的细胞和分子变化。

本文总共4100字，建议阅读16分钟

一、绘制AD时间空间转录组图谱

研究者分别取3、6、12和18月龄的AppNL-G-F（AD模型）小鼠和C57BL/6（正常）小鼠，总共12只。每次取材均取脑组织相邻3片切片，外侧2张用于HE染色，中间1张用作ST分析（图1）。ST共分析20个样本，得到10327个组织域（Tissue domain，TD），每一个TD中平均检测到31,283±7,441条UMI和6,578±987个基因，并根据ALLEN小鼠脑图谱，将所有TD匹配至14个脑区（图2）。通过对有效spots进行降维聚类分析，进而比较不同区域及不同样本间基因表达的差异（图2C和D）。不同解剖部位的TD数差异较大，比如内嗅皮质和丘脑分别有112和2114个TD（图2B）。最后作者将三个切片对齐，用Aβ负荷（6E10 staining）、反应性星形胶质细胞（GFAP）、神经元存在（NeuN）和细胞核（DAPI）来注释每个TD。所有信息均在https://www.alzmap.org/。

使用 t-SNE对10327个转录组根据大脑区域进行聚类（图2C）。覆盖海马体体细胞层（somatic layers of the hippocampus）的转录组学图谱和marker基因能清晰地分为CA1、CA3和DG亚区，表明ST足够强大，能够识别大脑的精确解剖区域。按照年龄和基因型也可进行良好的分离（图2D)。12个月龄和18个月龄的野生型（WT）小鼠的点重叠（图2D，紫色和红色），而AD鼠的转录组学图谱在这两个时间点（黄色和绿色）之间却有变化，与这一时期的病理学进展相一致。

图1 取材过程

图2 脑区分布与ST分析结果

二、Aβ沉积相关基因及功能

AppNL-G-F小鼠中的Aβ蛋白沉积始于3个月左右（图3A）。作者采用TD中Aβ荧光强度像素的标准差作为Aβ累积指数，从而区分Aβ轻度累积区和Aβ高度积累区（图3B）。计算每个脑区Aβ累积指数的平均值，结果与Aβ免疫染色结果一致（图3A和C），说明Aβ的累积从背侧向腹侧皮质、丘脑和海马体逐渐增多。

图3 Aβ负荷与基因表达的关系

为挖掘基因表达变化，作者进行两种差异基因分析。第一种比较不同基因型（AppNL-G-F；C57BL/6）小鼠之间的基因表达差异(基因型模型)。第二种研究Aβ积累对基因表达的影响（Aβ模型）。以Aβ沉积为中心，从里到外分别绘制5个浓度梯度环（R1~R5），筛选R5到R1基因表达量显著变化的基因(Aβ模型)。通过RNAscope实验验证了18个月龄Aβ小鼠模型中表达紊乱的6个基因（图3D和E）

作者比较了按照上述“基因型模型”（基因型 axis）之间差异基因的LFC（log2FoldChange）和不同Aβ模型（Aβaxis）之间差异基因的LFC，揭示了随不同基因型、Aβ沉积和年龄而变化的基因表达改变。对这些基因进行GOrilla分析，共得到13个功能亚类（图4A）。其中，抗原处理、趋化性、溶酶体降解和炎症在18个月时沿着Aβ轴和基因型轴上调。

除此之外，研究者还在10327个TD基因表达谱中，选取表达波动幅度top 50%的基因，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）得到12个模块（图4B）。其中，对Aβ沉积最敏感的分别为红色和紫色模块。与上述GO分析一致，红色模块代表髓鞘功能，沿着Aβ轴，基因表达量在早期升高、后期下降。而紫色模块代表趋化、溶酶体降解、炎症及抗原处理功能，在早期无明显变化，而在疾病晚期显著上调。

图4 GO分析与WGCNA分析

三、Aβ沉积相关基因的细胞定位

研究者将WGCNA分析中受Aβ影响最大的2个模块，第一大变化模块（紫色模块）命名为“斑块诱导基因（PIGs）”，第二大变化模块（红色模块）命名为“OLIG”模块，因其包含165个基因且主要在少突细胞中表达。其中，PIGs模块共包含57个基因，GO分析显示该基因集参与经典补体级联、补体级联触发效应机制、内吞作用、溶酶体降解、抗原加工呈递、免疫反应、氧化还原过程。进一步研究该模块的细胞特征，发现其与活化小胶质细胞（疾病相关小胶质细胞[DAM]和活化小胶质细胞[ARM]）、炎性星形胶质细胞相关（图5）。

OLIG模块共包括165个基因，将OLIG与已发表的小鼠单细胞数据库进行比较，证实其与少突胶质细胞密切相关，与活化小胶质细胞轻度相关（图5）。有意思的是，在3个月时，OLIG表达量与Aβ沉积呈正相关，而18个月时变为负相关（图6A和B），另外，不同脑区OLIG表达量与Aβ沉积的相关性也不同。对此，研究者在3月龄AppNL-G-F小鼠脑切片中，运用特异性结合4种OLIGs基因(Plp1,Mbp,Olig2, andCnp)的探针进行RNAscope试验。结果表明，即使在3个月时，上述4个OLIGs基因的表达量在致密淀粉样斑块周围也显著减少。因此，研究者推论：在轻度Aβ暴露下，OLIG模块中的基因高表达，但当Aβ沉积达到某一程度后，OLIG表达开始减少。

图5 WGCNA模块的细胞特征

图6 不同时间OLIG模块表达量

除此之外，研究者进一步运用ISS技术，探索和验证淀粉样斑块周围的多细胞反应。ISS使用定制探针，对18个月龄的AppNL-G-F和WT小鼠脑组织（各2只）进行PIG基因集和细胞标记(小胶质细胞：Itgam,Cx3cr1,Csf1r；星形胶质细胞：Slc1a3、Gfap、Clu；神经元：Syp; 少突胶质细胞：Plp1）定位，并用每个基因的荧光斑点数来量化基因表达。最终得到在54个PIG基因中，有51个基因被显著富集在R1，而C1qb表达量在R1中显著降低，并且，ISS结果与ST结果有很好的相关性（图8）。

图7.以Aβ沉积为中心的浓度梯度模型

图8.ISS验证PIG基因空间富集情况

为进一步将PIGs基因匹配至不同细胞类型，研究者还开发了一种方法：根据每一个荧光点半径5μm内的细胞标记基因的富集情况，将其分配到某一种细胞中。最终得到PIG模块对Aβ的反应主要是由小胶质细胞、星形胶质细胞引起的。比较AppNL-G-F和WT小鼠，PIGs基因富集到大致相同的细胞类型（图9），但部分基因表达有所改变，如C1qa,Gusb,Hexa,Lgals3bp及Plek基因在AppNL-G-F小鼠中更多地表达于小胶质细胞，而Gns,Gpx4及Itgb5更多地表达于星形胶质细胞。

图9. PIGs基因匹配至不同细胞类型

四、相关基因的表达量变化

研究者进一步探究Aβ沉积与OLIGs基因表达的相关性，并依据Aβ沉积量的由少到多，将ST 分析中的TD分成WT、Q4、Q3、Q2、Q1（WT->Q1, Aβ↑）。整体来看，这些基因的表达和连接随Aβ沉积增加而增加（图10）。其中，在轻度Aβ暴露下，OLIG模块表达和连接增加，但在高度Aβ暴露微环境中，OLIG模块表达减少。因此，OLIG模块的部分区域差异与Aβ暴露有关。

图10. PIGs基因表达的相关性变化

五、PIG和OLIG模块在人脑组织中的可视化

最后，研究者在临床样本中对小鼠结果进行验证，利用3例AD患者和3例非痴呆正常对照的尸检脑组织额上回样本进行原位测序（in situsequencing, ISS）。其中，纳入的AD患者处于疾病终末阶段，病理显示淀粉样蛋白C期、神经纤维缠绕Ⅴ~Ⅵ期，最终得到45个PIGs人同源基因和42个OLIG人同源基因。作者还基于ISS比较了人和鼠中PIGs分布的一致性，发现大部分PIGs在人中也分布在相同的细胞类型中。同样在人类中，PIG模块的3个子模块在对照组中由星形胶质细胞（绿色簇）和小胶质细胞（蓝色和橙色簇）表达（图11D）。然而，作者也鉴定出9个PIG在神经元中富集（LGMN、HEXB、HEXA、CTSB、CTSA、GNS、GPX4、CTSD和ITM2B），而2个PIG则在少突细胞中富集（LGALS3BP&CD9）。

最终，作者在45个可检测PIGs中只验证成功了18个PIGs在淀粉样斑块细胞处中显著富集，包括9个小胶质细胞PIGs、5个星形胶质细胞PIGs和5个表达于多种细胞类型的PIGs。有趣的是，作者发现在AD患者的小胶质细胞中APOE和ARPC1B表达显著，而在AD患者的星形胶质细胞中NPC2、S100A6、ITGB5、PRDX6和VSIR显著表达，这表明AD患者存在疾病相关的胶质细胞激活。

通过比较正常对照和AD患者中PIGs和OLIG模块的细胞特征（图11），进一步阐述了人脑组织中Aβ相关分子、细胞表达变化。

作者强调，当将这些数据与小鼠实验结果比较时，不但应考虑到物种差异，而且应考虑到，小鼠模型只反映了淀粉样斑块诱导的病理学现象，而在AD病人晚期，病理学变得复杂，并伴有Tau、坏死性凋亡等其他因素的复合作用，这是在鼠标模型中不存在的。事实上，小鼠模型的病理学结果反映了疾病的早期阶段。从人脑出现淀粉样斑块和神经元缠结到患者最终痴呆，可能需要20年。因此，人类中自淀粉样病变后又有许多额外变化发生，然而，在小鼠中鉴定的PIG和OLIG模块的许多基因在AD后期才表现出显著变化。

图11.人脑组织中利用ISS技术可视化PIG和OLIG模块

六、结论

本研究展示了ST和ISS技术在脑疾病相关研究领域的应用，通过ST得到疾病相关基因，再进行GO和WGCNA分析，ISS验证，进一步揭示AD发生发展过程中的细胞和分子变化机制。结果表明，Aβ不是一个“旁观者”，其沉积的确可诱导斑块附近所有细胞产生强烈且综合的反应。当然，未来有待更多研究，进一步确认清除淀粉样斑块是否可逆转AD病程，以及其最佳干预时机。

爱丽慕斯学术团队推出【Amazing brain】系列，解读脑科学相关重磅文章。

下期预告：小编解析【Amazing brain】系列第三篇，空间转录组研究肌萎缩侧索硬化（ALS）文章。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32702314/

参考文献

1. Chen WT, Lu A, Craessaerts K, et al. Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer's Disease. Cell. 2020;182(4):976-991.e19.

2. 中国脑科学研究主要"势力"概览2020版发布 https://mp.weixin.qq.com/s/57fPBBSKMytOOGz142xglg