1.引物是DNA还是RNA?
引物是在DNA分子复制时期引导作用的一段短RNA或单链DNA片段，可结合在脱氧核苷酸链上与之互补配对的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA聚合酶可由其3‘端开始合成新的核酸链。
细胞内DNA分子复制的过程：双链的解开→RNA引物的合成→DNA链的延伸→切除RNA引物，填补缺口并连接相邻的DNA片段。
在细胞中只有RNA聚合酶可以从头合成RNA，而DNA聚合酶由于它的保真系统决定它不能从头合成DNA单链。
在PCR仪中用的时DNA引物，是人工设计合成的，引物不会在PCR仪中复制，而是设计并配比好加入体系的。为什么不用RNA作为引物，因为RNA引物需要被切除，而PCR仪中没有这种酶，再说，若用的RNA引物被酶切除后将使这个新合成的DNA的两端都出现一段单链不稳定的DNA.
每一次都会有加长的单链产生，但其数目增长远小于目的片段，可忽略不计。
2.融合PCR
融合PCR技术（fusion PCR）采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外连接，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。
需要将A片段的下游引物含有B片段的一部分，B片段的上游引物含有A片段的一部分，这样分别扩增获得A和B就含有了互补片段。
如图中第一步中的P2含有一部分B片段序列，P3含有A片段一部分序列
参考：融合PCR的PPT介绍
注意事项：融合 PCR 实验-融合 PCR 实验-丁香实验 (biomart.cn)
3.临界温度退火PCR
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值（解链温度，50%双链打开时的温度）=4（G+C）+2（A+T）
复性温度=Tm值 -（5～10℃）退火温度（Annealing Temperature） 是指引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
4.Touch down PCR
一般简并引物使用的较多。
设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。
由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。
例：一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。
则：从65℃—>50℃（每2cycles降退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。
实验中如持续出现假象带（杂带），则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。
