写在前面
前述，为了开展基因组相关课题，获取准确的基因结构注释信息，我舍弃了 IGV-GSAme，因为他的实现不够优雅。基于多次尝试多次失败的基因组浏览器开发基因，我最后还是选择重新改造，并得到了 IGV-GSAman。这个软件推出来后，不少朋友都挺感兴趣。事实上，这块确实是刚需，主要场景有二：
- 基因组项目，往往需要配套高质量的基因结构注释，不然序列再准确，大伙也用不起来；
- 基因家族分析项目，由于绝大多数基因组并无准确的基因结构注释（拟南芥都有基因结构注释错误，不谈水稻，甚至其他更为复杂的基因组）；我基本每天都会收到基因家族分析文稿的审稿，看一下基因结构图就可以决定是否让重做。原因无他，基因家族分析的基础是正确的序列。在错误的基因组基因结构注释的背景下，没有对每一个成员进行准确结构矫正，其实论文从一开始就错了，必然不适合发表。
那么如何做「基因结构注释矫正」？当然是使用 IGV-GSAman。自然，最好的证据是基因结构得到 RNAseq 测序数据支持，尤其是外显子边界和UTR部分。于是涉及到回帖，如此会有两个新场景：
- 对整个物种全基因组进行结构注释矫正，如此结果很好，一劳永逸，但是工作量巨大，除非常年研究某一物种，否则不一定能投入足够资源去完成，即使有了 GSAman；
- 对物种感兴趣的基因集合，或者基因家族进行结构注释矫正，如此普遍适用于一般基因组课题，或者基因家族分析课题，以及普通湿实验的特定基因功能研究课题。
对于前者，往往实施人员有足够的计算资源可以进行大规模RNAseq读段回贴；但对于后者，则往往不然，许多时候，我们可能只有一台内存 4g ( 8g ) 的笔记本，同时电脑的硬盘资源也不是很充裕。但是，我们就关注到几个基因，那么如何对着这几个基因进行充分的基因结构注释矫正？如何利用 RNAseq 测序数据？
为此，我犹豫了许久，也加上最近有个可能的项目申请，几个老师一起讨论到，干脆就写出来，方便大伙使用（PS：如果这个插件有遇到问题，不要来问我，我挺忙的，直接去 TBtools技能易物群 即是）。命名为 Target Genome Region Mapping。
功能简单介绍
Target Genome Region Mapping 可以正常在 Windows （已测试）和 MacOS（没钱买设备，未测试）下使用。功能简单，基于用户提供的基因组序列以及目标基因组区间（一般为一些基因所在的染色体区间），进行有限制的 RNAseq 读段回帖。做了一些逻辑优化，所以整体表现跟进行全基因组回帖类似。
可以看到，是上下两个 Track （上面是 Target Genome Region Mapping 的结果，下面是全基因组作为参考输入的结果）的 MisMatch Pattern 是完全一样的，覆盖度只差1个read（这个是IGV窗口scale的问题，对基因结构注释矫正完全不影响），这说明不存在非特异性回帖。整体效果良好。具体放大这个区间来看
因为使用了 Target Region 限制，所以在现在区间外的部分，完全没有读段。那么好处是什么：
- 使用超低内存，拟南芥，对130+个MYB进行区间mapping，只需要用不到 5M内存（注意，是内存）；如果是对于一些超大基因组，比如辣椒 3G，实际编码序列很少，那么完全可以在笔记本上进行完成；
- 速度更快！因为限制了回帖区间，所以速度快得到。拟南芥的，30M RNAseq（大概20G的测序数据文件），跑下来只有 5min 左右一个样品；如果是全基因组，同等配置下，则需要跑一个多小时，更不谈大型基因组；
- 真的很准， idea 我想到的时候是兴奋的， 不过设计半天，发现类似的 idea 2020年有个大佬在他的软件更新上写进去了，anyway..... 还是有不少区别，从具体实现和最终目的，尽管concept是类似的。
回到主题....
插件的安装
直接在 TBtools 的插件商店获取即可，
点击安装会跳转到奶牛快传，注意！文件夹中有一个是插件文件，另一个压缩包是示例数据，示例数据如不无需要，其实不用下载。
插件文件下载好了，直接从主界面 Others -> Plugins -> Install Plugin 安装即可（目前完全开放，不确定后面是不是会因为用户问题太多，干脆不开放）
至于使用
打开插件，按照界面文本提示操作即可，
输出文件是 SAM 格式（注意到，因为做了 Target Region Mapping，所以文件也很小，对硬盘大小要求也变低），几乎所有人都能干这事~
实际示例
按照界面提示，设置参数即可，其线程数自己调整下。输出目录最好自己创建一个。
支持批量输入，比如有10个样品的测序数据（双端，一共20个文件），可以一次丢入。速度还是比较快。
注意到其中输入的是 AthMYB.bed ，信息如下
其实就是每个基因的染色体位置，因为假想目标就是矫正这些基因结构注释信息。或者说，具体查看。当然，其实如果你对其他区间，想看看他在不同样品里面到底有没有表达，你有很多几十个测序数据，想看看到底某个区间在那一套数据里面的测序深度最高，逻辑上，也可以试试。至于其他使用，大伙感兴趣都可以试试。
等待几分钟（具体看CPU和硬盘IO，抱歉，我发现我的新电脑，只花了2分钟，惊呆了），可以在输出目录看到输出文件。
对于这个文件，直接使用 TBtools 的 SAMtools GUI Wrapper 插件，进行排序即可（这个插件也在插件商店可以下载，也支持批量操作）。
排序结束，可以看到输出文件
其中有了两个文件就可以直接用 IGV 进行可视化了。
缩小后
也可以直接导入 bed 为 Region of Interest，进行超便捷多基因快速矫正
写在最后
路漫漫其修远兮~ 后来我仔细想想，写的每一个软件，每一个功能，似乎都是环环相扣，紧密关联。到底，还是期望能有更好用的工具，可以辅助更多科研工作人员开展工作，花更少的时间，做更好的工作。
We Make Practical Tools.
