感受态细胞（competent cell）是指用理化方法诱导细胞，吸收周围环境中的DNA分子，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。

其中大肠杆菌作为最早用于原核表达的菌株，其使用最为广泛，后续衍生也相当全面。其原理主要是，在进行重组质粒构建的过程中，将目的基因片段连入载体构建成含有目的基因片段的重组质粒并获得相应菌株。并通过感受态细胞与野生菌株比较确认是否得到所需基因片段。

由此在重组质粒构建中，感受态细胞是不可或缺的。接下来就以耀海生物常用的大肠杆菌为例学习其中涉及到的知识。

BL21

BL21是最常用于原核表达的菌株之一，其后续衍生包括BL21(DE3)、Rosetta、OrigamiB(DE3) 等一系列原核表达菌株。

BL21主要适用于非毒性蛋白的表达，因为其不含T7 RNA聚合酶，所以不适用于T7启动子驱动的蛋白表达(如：pET系列)。因为其具有大肠杆菌聚合酶，故可适用于tac或trc等使用大肠杆菌RNA聚合酶的原核系统的表达（如：pGEX，pMAL质粒）

操作方法：

1. BL21感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待感受态细胞融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置30分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟

4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

星耀小TIP：

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 诱导时，IPTG浓度可选（0.1-2 mM均可）

5. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间、温度、IPTG浓度需实验者优化。

BL21（DE3）

BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，该基因整合于BL21的染色体上，所以称为BL21(DE3)。可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。

操作方法：

1.快速转化操作方法（10min）

(1). 提前10分钟将用到的筛选培养基平板拿到37℃预热。

(2). F-BL21(DE3) 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置5分钟。

(3). 用200 μl枪将感受态细胞-DNA混合物转移到已经37℃预热的LB培养基上，涂均匀，表面无水渍。

(4). 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

2.快速热激转化操作方法（25min,可提高转化效率）

(1). F-BL21(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀,，冰中静置5分钟。

(2). 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟（晃动会降低转化效率）。加入700 μl不含抗生素的LB，37℃，200 rpm 复苏10分钟，涂板（均匀，表面无水渍）。

(3). 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

星耀小TIP

F-BL21(DE3)感受态细胞，无需42℃热激，37℃孵育步骤，只需冰浴，10min内完成转化、涂板操作即可。

BL21（AI）

BL21(AI)来源于BL21菌株，为Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，这两种酶的缺失有效防止异源蛋白在大肠杆菌体内的降解。在培养基中添加L-阿拉伯糖可诱导araBAD启动子下游T7RNA聚合酶的表达进而促进目的蛋白的表达。在培养基中添加葡萄糖可抑制araBAD启动子下游T7RNA聚合酶的表达进而抑制目的蛋白的表达。BL21(AI)感受态细胞适用于任何以T7启动子为基础的表达载体，能够进行高水平的重组蛋白表达。因为菌株能够对体内的T7 RNA聚合酶水平进行高效调节，BL21(AI) 感受态细胞能够表达对其他BL21细胞有毒性或抑制生长的蛋白。普通重组蛋白在BL21(AI) 菌株中获得产量和其他BL21菌株产量相当；对大部分毒性蛋白，在BL21(AI) 菌株中获得的产量高于BL21(DE3)pLysS菌株或BL21(DE3)菌株。

操作方法：

1. BL21(AI)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基（2YT或LB），混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含抗生素的2YT 或LB培养基上。5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

BL21(DE3)pLysS

BL21(DE3)pLysS菌株携带pLysS质粒，具有氯霉素抗性。pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达，适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。

操作方法：

1.BL21(DE3)pLysS感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含34 µg/ml氯霉素及所选质粒筛选抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

BL21 Star(DE3)

BL21 Star(DE3)菌株源于BL21(DE3)菌株，含有rne131突变（RNaseE基因），RNaseE基因的突变降低了內源RNase的积累，增强菌株细胞内mRNA的稳定性，从而提高异源蛋白的表达水平。主要适用于T7启动子表达载体(如pET系列)的高水平蛋白表达，同时含有大肠杆菌RNA聚合酶，也可用于非T7启动子表达载体（pGEX，pMAL等）的蛋白表达。由于BL21 Star(DE3)菌株的异源基因基础表达水平较高，所以不适合毒性蛋白的表达。

操作方法：

1.BL21 Star(DE3) 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

星耀小TIP：

1.大肠杆菌DH5α一般做克隆或保存质粒用，BL21用来做原核表达用。由于表达产量以及表达产物活性等各方面的原因，一般不使用DH5α作为表达菌。

2.Pet载体是大肠杆菌蛋白表达的首选载体，主要原因是目标基因严格受T7强转录及翻译信号控制，在宿主菌中无T7 RNA聚合酶时基因处于关闭不表达的状态。因此用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因可以避免目的基因表达蛋白对宿主菌造成毒性而引起质粒不稳定。

BL21 Star(DE3)pLysS

BL21 Star(DE3)pLysS菌株来源于BL21(DE3)，含有rne131突变（RNaseE基因），RNaseE基因的突变降低了內源RNase的积累，增强菌株细胞内mRNA的稳定性，从而提高异源蛋白的表达水平。主要适用于T7启动子表达载体(如pET系列)的高水平蛋白表达，同时含有大肠杆菌RNA聚合酶，也可用于非T7启动子表达载体（pGEX，pMAL等）的蛋白表达。由于BL21 Star(DE3)菌株的异源基因基础表达水平较低，所以适合毒性蛋白的表达。BL21 Star(DE3)pLysS菌株携带pLysS质粒，具有氯霉素抗性。pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，还可与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录活性，进而降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。pLysS质粒含有p15A复制起始子，可以和含有 pUC或pBR322等复制起始子的质粒兼容。

操作方法：

1. BL21 Star(DE3)pLysS感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。

4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

BL21-CodonPlus(de3)-RIPL

BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL菌株来源于Stratagene公司的BL21-Gold菌株，缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，从而减少对重组蛋白的降解，补充大肠杆菌缺乏的4种稀有密码子 (AGA, AUA, CCC, CUA)对应的tRNA (argU, ileY, proL, leuW)，提高外源基因，尤其是富含AT-或 GC-的真核基因在原核系统中的表达水平。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列、pGEX、pMAL等质粒的蛋白表达，同时具有四环素，氯霉素，链霉素，壮观霉素抗性。

操作方法：

1.BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT 或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Rosetta(DE3)

基因型：F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm(DE3) pRARE(argU, argW, ilex, glyT, leuW, proL) (CamR)

Rosetta 2(DE3)

基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3) pRARE2 (CamR)

Rosetta-gami 2(DE3)

基因型：D(ara-leu)7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL (DE3) F’[lac+ lacIq pro] gor522::Tn10 trxB pRARE2(CamR, StrR, TetR)

Rosetta-gami B(DE3)

基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm lacY1ahpC(DE3)gor522::Tn10trxBpRARE(CamR, KanR, TetR)

共有特征：

pRARE/pRARE2：赋予其Rosetta菌株的优点——补充大肠杆菌缺乏的6/7种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和[CGG])对应的tRNA，提高外源基因的表达水平。【使用时需添加34 µg/ml氯霉素防止质粒丢失】

DE3：整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶。

可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。

单独特征：

Rosetta 2(DE3)：Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，这两种酶的缺失有效防止异源蛋白在大肠杆菌体内的降解。

Rosetta-gami 2(DE3)：gor522::Tn10 trxB 赋予其Origami2菌株的优点——突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它们是还原途径的两个关键酶，其突变有利于高效形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性；同时该菌株不具有卡那霉素抗性，可用于具有卡那霉素抗性质粒的蛋白表达。

Rosetta-gami B(DE3)：除了gor522::Tn10 trxB以外，还具有lacY1基因 (半乳糖苷透性酶基因)突变赋予其Tuner菌株的优点——IPTG以均一速度进入体系中大肠杆菌的每个细胞，产生更加严格、均一的浓度依赖。

2.使用说明：

1．取100 μl感受态细胞置于冰浴中融化。

2．待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA（根据实际情况加入适量的DNA，通常100 μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min。

3．42℃热击45sec，然后快速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3min，该过程不要摇动离心管。

4．每个离心管中加入450 μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床， 150 rpm振荡培养45～60min使菌体复苏。

5．根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12~16h。

3.注意事项：

1．刚化冻的细胞转化效率最高，避免反复化冻。

2．整个动作要轻柔。

3．质粒质量和浓度等的差异会使转化效率有所下降。

OrigamiB(DE3)

感受态细胞是采用大肠杆菌OrigamiB(DE3)菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测，转化效率可达107 cfu/µg，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。每支感受态可以酌情分装使用，降低了实验的成本。质量稳定，使用方便，质优价廉。

基因型： F-ompThsdSB(rB- mB-) galdcmlacY1ahpC(DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,TetR)

抗生素耐药性：细胞具有卡那霉素和四环素抗性。

产品特点：

1. 适宜Amp抗性质粒。

2. OrigamiB（DE3）菌株包含突变的硫氧还蛋白还原酶thioredoxin reductase(trxB)和谷胱甘肽还原酶glutathione reductase(gor)基因，表达主要还原途径的两个关键酶。有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。

耀海分享

以上就是大肠杆菌感受态及其衍生菌株的感受态细胞的特性及其使用方式，由此可知作为最早被使用的原核的菌体，大肠杆菌感的应用之广泛和操作之成熟。通过以上的学习对于大肠杆菌的感受态细胞原理，特性及使用有一定的了解。下面就以耀海生物的某一项目具体了解。

项目目的旨在将质粒转化入三种大肠杆菌表达宿主 BL21(DE3)、BL21STAR(DE3)、BL21-AI，经抗生素抗性筛选阳性克隆，获得重组表达菌株;通过摇瓶诱导表达，SDS-PAGE 检测分析，确认目的蛋白表达及其表达水平，筛选优势菌株。

小编在此分享一下耀海生物生产车间内的大致的工艺生产流程图，以供参考：