本次精读的文献是今年发表1月26日在线发表在《Autophagy》上的一篇文章，通讯作者是武汉大学的孙蒙祥教授，他一直致力于被子植物生殖发育生物学和生殖细胞工程的研究。该研究证明了自噬途径参与了烟草花粉正常萌发的过程。
在先前鉴定烟草有关自噬基因的过程中，作者发现在花粉萌发的过程中与自噬相关的ATGs的表达量大大增加且在成熟的花粉当中达到最大，暗示着自噬的过程可能参与了植物正常的生长发育。于是作者就想以烟草为模型探究是不是这样。
幸运的是，作者通过多种手段，发现在花粉的萌发过程中，自噬的活性就大大增强。利用透射电子显微镜在萌发后30min观察，便发现自噬小体的存在，当用Con A（伴刀豆球蛋白A，能使得液泡酸化，并防止自噬小体降解）处理，发现自噬小体在靠近萌发孔的液泡中富集。在光学显微镜下，利用标记自噬小体的ATG8特异性抗体进行免疫检测显示，自噬小体在萌发孔处有明显的点状聚集。RT-qPCR也显示在萌发一小时后，大多数自噬相关的基因表达上调，随后下调，暗示自噬参与了花粉萌发的过程。
为了证明自噬确实参与了花粉萌发的过程，那就干掉他。于是他们就用了自噬的抑制剂3-MA，是磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）抑制剂体外处理花粉萌发。发现用抑制剂处理过后的花粉的确不大萌发。而且抑制剂处理萌发具有剂量效应（定性实验）。随后利用ATG8的抗体去标记自噬小体，发现加入3-MA后，自噬小体的形成的确变少（约70%）（定量实验）。至此，可以的确说，自噬的确参与了花粉萌发的过程。
为了进一步探究自噬在花粉萌发过程起的作用，作者将正常的花粉萌发的状态与用3-MA的处理的花粉萌发做对比。发现3-MA处理过程，萌发孔附进会形成凸起的细胞质结构，并且与其他细胞质显著不同。作者认为自噬的活性主要是为了去除这个凸起的细胞质结构。
在先前的研究中已经知道自噬的活性是与ATG这个家族的基因有关，于是作者开始探究机制。于是作者筛选了三个单拷贝ATG2,ATG5以及ATG7这三个基因进行探究（不是PtdIns3K复合体），并分别构建RNAi的载体。发现ATG2，ATG5以及ATG7（在附件里）的表达下调的确造成了花粉萌发率的下降，这与3-MA处理的表型很类似。并且ATGs的下调并不会导致花粉活力的下降但是只有约30%-50%的花粉能萌发。
下面的工作重心无疑是探究花粉萌发的失败与ATGs导致的自噬关系到底是怎么样的？作利用自噬水平评估的ATG8和ATG13作为报告子进行Western blot，可以看出ATG8和ATG13在RNAi的植物中表达量下调，暗示着当其中一个基因表达下调时，自噬水平将会被下调。利用免疫荧光检测，发现在RNAi的植株中，自噬小体的数目明显减少，为了区别自噬小体的减少到底时形成减少还是快速降解，利用Con A也不能使得自噬小体的数目恢复到野生型的水平，说明ATGs参与的是自噬小体的形成，利用crispr突变体atg5。进一步说明了的确是自噬小体形成出了问题。
为了进一步探究自噬小体的形成与ATGs的关系，作者利用ATG8的脂化程度进行分析，因为这对于自噬小体的形成是必不可少的。从WT和ATGs-RNAi的花粉中收集了所有的膜组分，然后在PLD（磷脂酶D）预处理之前或之后通过免疫印迹分析测定了ATG8的脂化作用。 在SDS-PAGE后，通常在免疫印迹中检测到ATG8–PE的迁移带比ATG8更快。可以看到野生型经过处理后跑的更快，证实它们是脂化的ATG8。可是在ATGs-RNAi的植物中，ATG脂化程度下降至一般一下。并且在ATGs-RNAi的植物中，也发现萌发孔处有凸起的细胞质层,并且对其面积进行了定量化。
为了探索花粉萌发初期自噬与脂质之间的关系，通过液相色谱-质谱法（LC-MS）对野生型和ATG RNAi植物的花粉进行脂质组分析。在野生型和ATG沉默的花粉中鉴定并定量了几类鞘脂，磷脂和甘油脂。潜在结构的正交投影-鉴别分析（OPLS-DA）显示了WT和ATG_RNAi系之间的明显分离，表明各个ATG RNAi系的脂质组成存在明显差异。随后对于参与自噬的脂类进行详细分析，三种磷脂： phosphatidylinositol (PI), phatidylethanolamine(PE) 和phosphatidyl-choline参与自噬小体的形成，其中PI能在自噬小体成核过程中被VPS34磷酸化形成PtdIns3K，其表达水平在RNAi的植株中大大降低。此外在ATGs_RNAi的花粉中，分别为囊泡成核和吞噬细胞扩张所必需的PE和磷脂酰胆碱的表达水平也降低了，同时伴随着一些溶血PEs（LysoPE）和溶血磷脂酰胆（lysophosphatidylcholine）的表达水平升高。
此外在哺乳动物中，鞘脂的外源性神经酰胺（Cer）能够通过抑制氨基酸摄取并诱导BECN1 / Beclin1的表达来激活自噬，即酵母VPS30 / ATG6的哺乳动物直系同源物。 有趣的是，ATGs_RNAi的花粉中的Cer水平显着高于野生型。从内部线粒体重新分布到外部线粒体表面的磷脂心磷脂（CL）对于受损线粒体的自噬是至关重要的。 相对于野生型，RNAi植物中的花粉中CL积累至较高水平。磷脂酰甘油（CL合成的重要底物）也积累在ATGs_RNAi的花粉中。 同理，与WT相比，在ATGs_RNAi的花粉中溶血磷脂酰甘油（用于合成磷脂酰甘油的前体）的水平也增加了。三酰基甘油（TAG）是许多植物花粉粒中脂质体内存储的主要成分。 抑制自噬可能导致植物和哺乳动物体内脂质的增加。所以，作者重点研究了TAG和二酰基甘油（DAG，TAG合成中的中间代谢物）的组成。 在ATGs_RNAi中均观察到TAG和DAG的大量积累。 有趣的是，一种的两亲脂质亚类，ω-羟基脂肪酸，在自噬缺陷型花粉中也积累了较高的水平。以上研究说明自噬导致的膜组分的变化保证花粉的正常萌发。
最后作者利用串联质谱标记（TMT）进行定量质谱分析，探寻ATG2和ATG5下游蛋白表达的变化。其中4.3% 和2.8%在ATG2- 和 ATG5-silenced pollen中上调， 2.6% 和2.8% 下调。所以作者认为自噬途径对于花粉的蛋白组来说具有重要作用。且ATG2_RNAi和ATG5_RNAi中up和down存在较多的overlap可能调控了共同的途径。但是GO分析显示，ATG2主要富集含核糖体蛋白和核糖核蛋白相关组分，而ATG5富集含肽酶和蛋白酶体相关组分，表明其功能的差异性。在细胞组分方面，我们可以发现线粒体质子运输ATP合酶复合物相关的蛋白下调明显，细胞膜组分上调明显。生物学过程中，下调的蛋白富集于细胞氮化合物的生物合成过程和ATP合成与质子运输耦合，而上调的蛋白富集于小GTPase介导的信号转导。因此作者认为，ATG2和ATG5主要通过线粒体ATP与蛋白质合成途径来影响花粉萌发。为了证实这一结果，作者还鉴定富集的途径，发现上调和下调的蛋白质都被归类为与氧化磷酸化有关的途径。
这篇文章揭示了自噬是如何参与花粉萌发的过程，并且揭示其对于脂质组分的影响以及下游蛋白的影响。但是这些ATG蛋白似乎能在花粉萌发过程中起作用，似乎冗余，但是每个RNAi的植株都有表型，这让我感觉到很奇怪，如果能做个双突变或者三突是不是更好。此外，其余在花粉萌发过程中的表达有变化的ATG其功能是什么？还有待进一步挖掘。
