In-Fusion方法及引物的设计
本章构建PHD2的重组表达载体时使用的是pET-43.1(+)系列中的pET-43.1b(+)，目的是通过Nus•Tag促进融合蛋白可溶性表达，His•Tag作为亲和标签用于后期目的蛋白的纯化。
2.4.2 In-Fusion方法及引物的设计
2.4.2.1 In-Fusion Cloning方法 常用的TA克隆、限制性酶切克隆及平滑末端克隆等方法存在连接效率低、需要特定限制性酶切位点以及耗时较长等缺点，In-Fusion Cloning方法旨在用一步法将任意DNA片段克隆到任意线性化载体中，技术能够实现0.05-15kb DNA片段的克隆，还可以同时克隆两个或多个DNA片段，无需亚克隆。整个过程不附加多余序列，真正意义上实现了完美的无缝克隆。
目前，In-Fusion技术已被应用到国内外许多科研工作中。Roger等人使用In-Fusion方法实现了DNA片段与载体任意位置的无缝融合，该方法操作简便并且易于实自动化。Martina等人用In-Fusion方法将目的基因高效地克隆至一些列载体系统上，表达出不同的重组单克隆抗体，为早期治疗及诊断的评估奠定了基础。Chad等人研究发现牛痘病毒DNA聚合酶可以增大In-Fusion Cloning的反应效率，实现插入序列高通量的定向克隆。在国内，张明娟等人首次报道了使用In-Fusion技术将钠泵α3截断性片段插入pGEX-6P-1载体中，表达出GST-Trf-α3融合蛋白。刘超等人发现用T4 DNA连接酶处理后，不能成功地将较大的SCN1A cDNA基因（6.0Kb）克隆至pCMV-IRES-DsRed（5.2Kb）真核载体上，后来改用In-Fusion技术成功地构建了pCMV-SCN1A-IRES-DsRed重组载体，实现了Ⅰ型钠通道与红色荧光蛋白的共表达。韩凯等人也研究发现In-Fusion是一种通用、快速、高效的构建重组表达载体的方法。
本论文首先通过限制性酶切法得到线性化载体，设计特异性引物扩增目的基因使其两端与线性化载体末端具有15个同源序列。然后用PrimeSTAR® HS DNA聚合酶（宝生物公司）进行PCR反应，充分确保了目的基因的高保真性。最后用In-Fusion专利酶将带有同源序列的目的基因与线性化载体融合，Cloning Enhancer的加入消除了PCR反应液中引物二聚体和dNTP等的影响，该反应只需15min且反应液可以直接转化大肠杆菌，无需纯化步骤。因此，整个过程实现了PHD2基因快速、简单、高效地克隆至pET-43.1b(+)，成功构建了pET-43.1b(+)-PHD2原核表达载体。
2.4.2.2 In-Fusion引物的设计 引物的设计步骤在In-Fusion方法中非常关键，只要插入序列和载体两端具有至少15bp同源序列，就可以通过In-Fusion反应实现而者的无缝融合。因此，在设计In-Fusion 的PCR引物时，必须使引物末端带有与线性化载体末端相同的同源序列，In-Fusion引物设计的基本原则是：
（1）引物的5’末端应包含与线性化载体末端相同的15个碱基序列。
（2）引物的3’末端应满足以下条件：包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列；GC含量控制在40~60%；Tm值在58~65℃之间，且正向引物与反向引物Tm值差别应小于4℃；避免含有重复的核苷酸，最后5个核苷酸不要多于两个G（鸟嘌呤）或C（胞嘧啶）。
（3）避免引物序列之间的互补，防止发夹结构及引物二聚体的形成。
本研究使用在线工具http://bioinfo.clontech.com/infusion/，将pET-43.1b(+)质粒序列、限制性内切酶SacⅠ及用于扩增目的基因的引物序列输入相应位置，然后按照一系列步骤及引物设计原则设计出一对特异性In-Fusion引物，很大程度上简化了引物设计步骤。
3.4.3融合标签对目的蛋白的影响
外源蛋白在大肠杆菌中表达时经常会聚集成不溶的包涵体，为后期的纯化及活性研究带来困难，而构建融合蛋白是促进外源蛋白可溶性表达的策略之一。大肠杆菌NusA（N-利用质A）作为一种亲水标签，使一些在大肠杆菌中表达时不溶的蛋白在N端融合NusA后，可以在极大程度上增强融合蛋白的溶解性。
本研究通过pET-43.1b(+)系统在目的蛋白N端融合了Nus•Tag标签，成功地以可溶性融合蛋白的形式表达出Nus-PHD2，但融合标签的加入也不可避免的为目的蛋白的研究带来一些影响：（1）NusA蛋白作为一种分子量较大的特异性促溶因子，可能会对目的蛋白的结构产生空间位阻，影响PHD2的活性；（2）若要切除Nus•Tag标签，就必须使用成本较高的特异性蛋白酶作用在专一的酶切位点上，一般酶切步骤还需要进行反应条件的优化；（3）融合标签虽然增大了目的蛋白的表达量及溶解度，但复杂的纯化步骤以及标签的切割后纯化过程会造成目的蛋白的损失，使其产量无法满足后续研究的要求。 融合标签在外源蛋白表达和纯化上的应用是一个不断探索的过程，相信随着对蛋白质结构及包涵体形成机理等方面研究的发展，融合蛋白技术会越来越成熟，在蛋白表达领域发挥更大的作用。
