Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis，if=27.407 Cancer Cell. 2014 Apr 14;25(4):501-15. doi: 10.1016/j.ccr.2014.03.00

背景

microRNA可以被肿瘤细胞以外泌体的形式分泌出来，可以与周边的细胞进行crosstalk，进而起到远程调控的作用。可进行crosstalk的周边细胞种类包括：肿瘤微环境中纤维细胞、血管内皮细胞、同类肿瘤细胞等等。本文题目来看，是肿瘤分泌mir-105，作用于远处血管内皮细胞，调节血管内皮细胞屏障功能，而血管内皮屏障作用是肿瘤转移的一个步骤。两个基本内容mir105调节靶基因和肿瘤转移都是很基础的概念，为何能发表于cancer cell这种27分的杂志上呢？

我的研究方法

首先利用研究exosome的方法，证实肿瘤细胞可以分泌exosome，利用检测方法检测exosome内mir-105表达量增高。exosome的研究方法包括：提取分离的方法、电镜观察法、exosome表面特定标志物western检测；microRNA的pcr检测方法。然后验证外泌体内miR-105的生物学功能，需要将肿瘤细胞与血管内皮细胞共培养，观察血管内皮细胞的连接方式变化；制作乳腺癌动物模型，观察肿瘤转移数目和取血管内皮细胞观察连接方式改变；检测乳腺癌患者血清内miR-105表达水平，观察转移评价指标（DFS）。最后对miR-105调节的靶基因进行验证，靶基因通过网站筛选、双荧光素酶实验验证，验证的靶基因具有调节血管内皮细胞连接方式的生物学功能；可以行靶基因的rescue实验，证实miR-105调节的充要条件。

转移性肿瘤细胞分泌的exosome可以内皮细胞的转移

首先观察转移性肿瘤细胞和非转移性肿瘤细胞分泌的exosome功能学差异。转移性乳腺癌细胞 MDA-MB-231、乳腺上皮细胞MCF-10A。超速离心法分离exosome，电镜下观察。因为主要证明其与血管内皮细胞的关系，所以通过荧光染色验证人类微血管内皮细胞（HMVECs）可以摄取肿瘤细胞分泌的exosome。荧光电镜和流式细胞仪两种方法检测证实。transwell检测接受exosome后的HMVECs迁移功能的变化。结果显示：转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的exosome，可以被HMVECs摄取，进而影响内皮细胞的迁移功能。那么exosome中哪种成分才是调节迁移的主要分子呢？

exosomes研究方法：电镜观察、Dil颜色标记后电镜下观察或者流式细胞仪检测。中图可以发现Dil标记的exosome转染入HMVECs中。

mir-105是转移瘤细胞分泌exosome中的调节迁移的分子

通过Solexa深度测序的方法检测转移性exosome和非转移性exosome中microRNA的表达差异，发现基本相同，也列表显示出差异microRNA表。但是最终还是选择了mir-105，而且据说还靶向TJP1：tight junction protein 1紧密连接蛋白（OZ1）。没有交代选择miR-105的标准，一般选差异最明显，作者只是说：we further focused on mir-105。之后选取数十种乳腺癌细胞系，有的是原发肿瘤细胞系，有的是乳腺癌胸腔积液分离出来的转移性细胞系。分别检测的原发瘤细胞和转移细胞系细胞内和exosome中miR-105的表达水平，发现不论是细胞内还是exosome中，在转移性细胞系中miR-105都高表达，提示miR-105是乳腺癌转移特异相关。

多种乳腺癌细胞，包括原发癌细胞和胸腔积液分离出来的转移性乳腺癌细胞系，miR-105在转移性癌细胞系中高表达，作图为细胞内miR-105，右图为exosome内miR1-05

进一步验证转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的exosome可以将miR-105转入内皮细胞。分别将MDA-MB-231和MCF-10A分泌的exosome与HMVECs共培养，分别利用PKH67和Cy3标记exosome和miR-105，荧光显微镜下观察不同染色的定位情况。最终证实MDA-MB-231分泌的exosome中miR-105可以转移至HMVECs中，而不是exosome刺激HMVECs产生大量miR-105.

前期的exosome分泌、转移内容证实之后，下面就对miR-105影响内皮细胞的功能进行深入研究，或者说miR-105调节的靶基因和生物学功能深入研究。我会先做一些生物学功能实验：干扰内皮细胞miR-105表达水平，观察迁移侵袭的变化；如果HMVECs培养能形成微血管，甚至可以观察微血管内皮细胞间距的变化。然后荧光素酶验证靶基因。

miR-105可以下调内皮细胞TJP1，破坏内皮细胞形成的屏障

首先双荧光素酶实验，验证miR-105可以靶向抑制TJP1基因，之后再在内皮细胞水平，转染miR-105之后，观察内皮细胞OZ-1 mRNA和蛋白的表达抑制。该实验干预内皮细胞内mir -105表达方法，不是使用siRNA或者miR-up等合成化合物，而是直接使用MDA-MB-231分泌的exosome，以及其他各种对照（MCF-10A），还涉及了rescue实验。总之证实了miR-105可以靶向抑制内皮细胞ZO-1蛋白的表达。以下内容为更专业的研究内皮细胞连接的方法。

1、培养基中内皮细胞连接成片，细胞间有细胞连接体。通过免疫染色ZO-1、OOccludin和E-caderin等细胞连接体，后免疫荧光电镜观察这些连接体的表达变化情况。

细胞连接蛋白然后后观察，miR-105干预抑制ZO-1和Ocludin的表达

2、HMVECs细胞间通透性检测，permeablity assay：了解内皮屏障变化的直接效果，利用transwell小室，内皮细胞培养形成平铺一层内皮细胞膜，上层加罗丹明染料颗粒，后可以利用exosome调节内皮细胞的连接松紧程度，观察转入下层的罗丹明颗粒数量。甚至可以测量内皮细胞通透性阻抗electrical Resistance。除了观察罗丹明，还可以GFP标记MDA-MB-231癌细胞，观察癌细胞迁移数目的变化。

permeability assay示意图，用于检测内皮细胞通透性

3、3D vascular sprout assay，3D培养内皮细胞，形成微血管树，然后给予exosome后，观察测量微血管树的变化，评估exosome对微血管的影响。

3D vessel sprouting模型，观察血管结构变化，miR-105明显抑制血管spouts形成数量

除了阐述miR-105的上述生物学功能，更重要的是证实ZO-1是介导miR-105生物学功能的充要条件，需要设计rescue实验，证明恢复ZO-1后，可以逆转miR-105的生物学功能改变。这部分内容不需要单独列出，在阐述mi-105的功能学变化过程中，多加入一组rescue组别即可，因为最终检测的biomarker都是一样的。

以下内容为动物模型水平，验证miR-105的生物学功能。

在动物模型水平，miR-105诱导血管通透性、促进肿瘤转移

动物选取NOD/SCID/IL2Rγ null mice，用miR-105含量不同的exosome注射尾静脉处理干预，（exosome from MCF10A/vec (low-miR-105), MCF-10A/miR-105 (high-miR-105), or MDA-MB-231 cells (high-miR-105), or PBS as control）。 动物模型如何评估血管通透性和肿瘤转移性。

动物模型静脉注射染料罗丹明，观察肿瘤常见转移器官肺和脑组织中罗丹明渗透情况，如果肺或脑组织中罗丹明染料增多，提示血管通透性增加。

血管内注射罗丹明染料，之后荧光电镜检测不同分组后，肺脑组织中罗丹明渗透情况，罗丹明越多，提示血管通透性越高。

动物模型，评估肿瘤转移性，最常见的指标是转移瘤数目或大小。而本文则将移植瘤细胞首先利用荧光标记，然后在心内注射形成移植瘤，3周之后，提取肺和脑组织中荧光基因的表达量，表达量越高提示转移瘤负荷越大。

PCR检测常见肿瘤转移部位的荧光基因的表达水平，用以评估转移瘤负荷

当然，肝肺组织病理切片，含量不同miR-105处理干预之后，免疫荧光染色观察OZ-1及occludin等细胞连接蛋白表达情况也可间接说明问题。（CD31染色提示血管结构，观察血管结构内OZ-1连接蛋白表达降低）。

免疫荧光观察血管内皮细胞之间ZO-1表达含量变化

动物模型，提高低转移性乳腺癌细胞中miR-105，可以促进肿瘤的转移

之前都是利用mir-105含量不同的exosome做干预，观察血管通透性和转移瘤负荷。那么原发瘤中miR-105高表达后，是否能起到同样的作用呢？首先制作高表达miR-105的移植瘤模型，选取 an MCF-10A-derived tumorigenic line, MCFDCIS, which forms lesions similar to comedo ductal carcinoma in situ that spontaneously progress to invasive tumors为细胞模型，检测细胞miR-105表达含量、细胞内ZO-1表达水平，以及细胞的迁移和转移属性，证实模型成功。之后同上一部分，检测罗丹明染料评估血管通透性、检测荧光基因评估转移瘤负荷，以及病理切片ZO-1染色。结果证实原发瘤高表达miR-105，同样可以抑制肺脑组织ZO-1表达、增加血管内皮通透性、促进肿瘤转移。

动物模型，抑制miR-105表达，可以抑制转移，恢复血管内皮通透性（rescue实验）

为了证实，miR-105抑制剂能否逆转上述生物学功能变化，具有治疗意义。动物模型制备同上一部分，干预处理措施为：尾静脉注射anti-mir-105，检测指标同上。结果显示anti--miR-105具有治疗意义。

最后真实病例数据提供支持：乳腺癌患者miR-105表达水平与ZO-1表达和转移预后相关

检测瘤组织和血清mir-105表达水平，是否具有一致性，以及miR-105与ZO-1具有负相关，回顾性分析转移瘤和未转移瘤患者血清miR-105表达水平，高表达者发生转移率更高。或者生存分析预后。

临床数据支持，图表显示方式 提示临床研究不够规范。作者肯定是搞基础研究的。

总结

microRNA研究套路：细胞生物学功能、靶基因验证及介导功能的必要性、动物模型试验，最后在临床病例寻找证据，支持机制研究结论。这是基础研究的逻辑方式，首先在分子机制研究透彻了，然后找临床数据支持。而临床研究逻辑则相反：首先发现有临床现象和临床数据支持，然后在深入探讨细胞和动物水平有没有该现象，如果有的话，最后深入探讨分子基因互作机制。另外研究血管通透性相关转移，可以参考该文的实验方法。•

参考资料：

NOD/SCID/IL2γ null mouse：

 NOD（non-obese diabetes）遗传背景：自发I型糖尿病；其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱；先天免疫系统，如补体系统和树突状细胞功能降低。

• Prkdcscid ：Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，小鼠的功能性T和B细胞缺失 ，淋巴细胞减少，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency, scid）。

• Il2rgnull： Interleukin-2受体的gamma链（IL-2R γc，又称CD132）位于小鼠X染色体上，是具有重要免疫功能的细胞因子Il2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受体亚基，该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。

B-NSG小鼠：综合了NOD-SCID-IL2rg背景特征，具有重度免疫缺陷表型，无成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失等。非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。

优点

• 迄今世界上免疫缺陷程度最高的工具小鼠；

• 与NOD-scid小鼠相比寿命更长，平均长达1.5年；

• 对人源细胞和组织几乎没有排斥反应；

• 少量细胞即可成瘤，依赖于细胞系或细胞类型；