写在前面：western blot，这个不做个十次八次，基本出不来好看条带的实验，相信让很多小伙伴都感到头秃。不过只要持之以恒，善于总结，问题不大，随着实验次数的增多，会持续更新内容，个人见解存在一定局限性，欢迎一起交流哈~
做胶
Q. 注意事项
配缓冲液过程中，过硫酸铵最后加，防止出现过多气泡。
温度：温度越高凝固越快，胶通常在0.5-1h内凝固最好。充分凝固后可保鲜膜包裹4℃过夜，第二天使用。
Q. 如何判断样品总蛋白的提取是否成功？
跑胶前：蛋白浓度检测，浓度低可能是提取不成功。
转膜后：丽春红染色，正常的话可以看到很多蛋白条带。
显色后：内参及目的蛋白的检测。
上样
Q. 上样时有的样品沉淀，有的清亮？
1.考虑没有完全变性，适当提高SDS浓度，同时延长煮沸时间。
2.考虑蛋白浓度过高，加入缓冲液稀释。
电泳
Q. 影响电泳结果的因素
1. 电压：低电压下筛选效应充分，条带漂亮。
2. 胶的均匀度：胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。
Q. 条带形状
︶笑脸型：凝结冷却不均匀，中间冷却不好。
︵皱眉状：可能凝胶和玻璃板底部有气泡。
拖尾：样品溶解不好
纵向条纹：样品中有不溶性颗粒
条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散：加样量过多溢出
Q. 大分子量蛋白转移效率低？
转移缓冲液加SDS（终浓度0.1%）；提高转移电压/电流；增加转移时间
Q. 小分子量蛋白转移需注意？
使用0.22um 或0.1um 的NC膜；减少转移时间，30min足够。
转膜
我们用的是湿转法，效率比较高，如果目的蛋白很小，可以考虑半干转。
Q. 过转和转膜不充分？
对于大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不用考虑过转情况，看条带对应的marker是否转上，即可确定自己的条带是否转上。如果没有，适当增加电压/电流，延长时间，还有避免胶和膜中间有气泡。
小分子量（<15kd）尤蛋白容易出现过转，同样丽春红染膜或观察marker即可确认有没有过转。
Q. PVDF的预处理？
PVDF膜先置于甲醇中处理10 s，然后浸于电转缓冲液中10 min，再夹三明治。NC膜则不需要预处理。
封闭
我们用的是5%脱脂奶粉，10%TBS缓冲液配制。
Q. 封闭时间
正常情况，室温封闭1h即可。如果曝光背景过高，可以适当延长封闭时间至2-5h，也可以4℃过夜，封闭时间过长并不会导致检测信号减弱。
如果延长了封闭时间，背景还是高。考虑抗体浓度过高，可稀释使用；目的蛋白丰度太低，信号弱。
Q. 封闭液有杂质颗粒?
（静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层）
牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒，对封闭无益。可以在转膜开始之后配好牛奶，在充分搅拌好的前提下，静置于4℃。使用时不要担心牛奶不均而特意混匀，只吸上层部分完全ok。
孵抗体
Q. 如何提高磷酸化抗体的检测质量？
提高蛋白上样量；适当增加封闭时间，延长一抗孵育时间；封闭的选择：5%脱脂奶粉？ 5%BSA？；磷酸酶抑制剂；样本低温操作，最好是新鲜样品，反复冻融易降解。
显影
Q. 目的条带很弱？
加大上样量，调整抗体比例，转膜效率。
Q. 背景太深？
降低抗体比例；封闭液中加去垢剂：吐温20；降低上样量；用其他蛋白做封闭液：5%BSA，serum；
Q. 条带有时清晰，有时弥散？
样品可能存在降解；转膜不及时造成扩散。
