写在前面

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推荐先按顺序阅读以下文章：
1.文献阅读：(Seurat V1) 单细胞基因表达数据的空间重建
2.文献阅读：(Seurat V2) 整合跨越不同条件、技术、物种的单细胞转录组数据
3.文献阅读：(Seurat V3) 单细胞数据综合整合
4.文献阅读：(Seurat V4) 整合分析多模态单细胞数据
5.文献阅读：(Seurat V5) 用于集成、多模态和可扩展单细胞分析的字典学习

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目录

• 1 设置 Seurat 对象
• 2 标准预处理工作流程
  • 2.1 QC 和选择细胞进行进一步分析
• 3 数据归一化
• 4 识别高变特征（特征选择）
• 5 标准化数据
• 6 执行线性降维
• 7 确定数据集的维度
• 8 细胞聚类
• 9 运行非线性降维 (UMAP/tSNE)
• 10 寻找差异表达特征（cluster biomarkers）
• 11 将细胞类型标识分配给类群
  :::

1 设置 Seurat 对象

在本教程中，我们将分析 10X Genomics 免费提供的外周血单核细胞 (PBMC) 数据集。在 Illumina NextSeq 500 上对 2,700 个单细胞进行了测序。原始数据可以通过以下链接下载：

# 数据下载
https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz

我们从读取数据开始。Read10X() 函数从 10X cellranger pipeline 的输出中读取数据，返回一个唯一的分子识别 (UMI) 计数矩阵。此矩阵中的值表示在每个 cell (column) 中检测到的每个 feature (i.e. gene; row) 的分子数。

接下来我们使用 count matrix 创建一个 Seurat 对象。该对象作为一个容器，包含了单细胞数据集的 data (like the count matrix) 和 analysis (like PCA, or clustering results)。有关 Seurat 对象结构的技术讨论，请查看 seurat 的 GitHub Wiki。例如，count matrix 存储在 pbmc[["RNA"]]@counts 中。

# Seurat GitHub Wiki
https://github.com/satijalab/seurat/wiki

导入软件包和数据集：

library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork)

# 导入 PBMC 数据集
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "../data/pbmc3k/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
# 初始化 Seurat 对象，使用原始数据（non-normalized data）
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
pbmc

## An object of class Seurat 
## 13714 features across 2700 samples within 1 assay 
## Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features)

计数矩阵中的数据是什么样的？

# 让我们检查前三十个细胞中的一些基因
pbmc.data[c("CD3D", "TCL1A", "MS4A1"), 1:30]

## 3 x 30 sparse Matrix of class "dgCMatrix"
##                                                                    
## CD3D  4 . 10 . . 1 2 3 1 . . 2 7 1 . . 1 3 . 2  3 . . . . . 3 4 1 5
## TCL1A . .  . . . . . . 1 . . . . . . . . . . .  . 1 . . . . . . . .
## MS4A1 . 6  . . . . . . 1 1 1 . . . . . . . . . 36 1 2 . . 2 . . . .

矩阵中的.值代表 0（未检测到分子）。由于 scRNA-seq 矩阵中的大多数值都是 0，因此 Seurat 尽可能地使用稀疏矩阵表示。这会显着节省数据的内存和速度。

dense.size <- object.size(as.matrix(pbmc.data))
dense.size
## 709591472 bytes
sparse.size <- object.size(pbmc.data)
sparse.size
## 29905192 bytes
dense.size/sparse.size
## 23.7 bytes

2 标准预处理工作流程

以下步骤包含 Seurat 中 scRNA-seq 数据的标准预处理工作流程。这些代表了基于 QC 指标的细胞选择和过滤、数据归一化和标准化，以及高变特征的检测。

2.1 QC 和选择细胞进行进一步分析

Seurat 允许您根据任何用户定义的标准轻松探索 QC 指标和过滤细胞。社区常用的一些质量控制指标包括：

• 在每个细胞中检测到的独特基因的数量。
  • 低质量细胞或空液滴通常含有很少的基因
  • Cell doublets 或 multiplets 可能表现出异常高的基因计数
• 同样，细胞内检测到的分子总数（与独特基因密切相关）
• 映射到线粒体基因组的 reads 百分比
  • 低质量/垂死的细胞通常表现出广泛的线粒体污染
  • 我们使用 PercentageFeatureSet() 函数计算线粒体 QC 指标，该函数计算源自一组特征的计数百分比
  • 我们使用以 MT- 开头的所有基因的集合作为一组线粒体基因

# [[ 运算符可以向对象 metadata 添加列。这是存储 QC 统计数据的好地方
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

Seurat 中的 QC 指标存储在哪里？

• 在 CreateSeuratObject() 过程中自动计算独特基因的数量和分子总数
  • 您可以在对象地 meta data 找到它们

# 显示前 5 个细胞的 QC 指标
head(pbmc@meta.data, 5)

##                  orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt
## AAACATACAACCAC-1     pbmc3k       2419          779  3.0177759
## AAACATTGAGCTAC-1     pbmc3k       4903         1352  3.7935958
## AAACATTGATCAGC-1     pbmc3k       3147         1129  0.8897363
## AAACCGTGCTTCCG-1     pbmc3k       2639          960  1.7430845
## AAACCGTGTATGCG-1     pbmc3k        980          521  1.2244898

在下面的示例中，我们可视化 QC 指标，并使用它们来过滤细胞。

• 我们过滤具有超过 2,500 或少于 200 的唯一特征计数的细胞
• 我们过滤线粒体计数 >5% 的细胞

# 将 QC 指标可视化为小提琴图
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

# FeatureScatter 通常用于可视化特征与特征之间的关系，但也可以用于由对象计算的任何内容，即对象 metadata 中的列、PC 分数等。

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2

pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)

3 数据归一化

从数据集中删除不需要的细胞后，下一步是归一化数据。默认情况下，我们采用全局尺度归一化方法“LogNormalize”，通过总表达量对每个细胞的特征表达测量值进行归一化，将其乘以 scale factor (10,000 by default)，并对结果进行 log-transforms。归一化值存储在 pbmc[["RNA"]]@data 中。

pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

为清楚起见，在前面的代码行（以及未来的命令中），我们为函数调用中的某些参数提供了默认值。但是，这不是必需的，可以通过以下方式实现相同的行为：

pbmc <- NormalizeData(pbmc)

4 识别高变特征（特征选择）

接下来，我们计算在数据集中表现出高细胞间变异的特征子集（即，它们在某些细胞中高表达，而在其他细胞中低表达）。我们和其他人发现，在下游分析中关注这些基因有助于突出单细胞数据集中的生物信号。

Seurat V3 文章中详细描述了 Seurat 的过程，并通过直接对单细胞数据中固有的均值-方差关系进行建模来改进以前的版本，并在 FindVariableFeatures() 函数中实现。默认情况下，我们为每个数据集返回 2,000 个特征。这些将用于下游分析，如 PCA。

pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

# 确定前 10 个变异最大的基因
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)

# 绘制带标签和不带标签的变异特征
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
plot1 + plot2

5 标准化数据

接下来，我们应用线性变换（"scaling"），这是在 PCA 等降维技术之前的标准预处理步骤。ScaleData() 函数：

• 改变每个基因的表达，使细胞间的平均表达为 0
• 缩放每个基因的表达，使细胞间的方差为 1
  • 此步骤在下游分析中给予同等权重，因此高表达基因不会占主导地位
• 结果存储在 pbmc[["RNA"]]@scale.data 中

all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)

这一步耗时太长了！我可以让它更快吗？

标准化是 Seurat 工作流程中的重要步骤，但仅限于将用作 PCA 输入的基因。因此，ScaleData() 中默认仅对先前识别的可变特征（2,000 by default）执行标准化。为此，请省略上一个函数调用中的 features 参数，即:

pbmc <- ScaleData(pbmc)

您的 PCA 和聚类结果将不受影响。然而，Seurat 热图（如下所示，使用 DoHeatmap() 生成）需要对热图中的基因进行标准化，以确保高表达的基因不会主导热图。为了确保我们稍后不会将任何基因遗漏在热图中，我们将标准化本教程中的所有基因。

如何删除不需要的变异来源，如 Seurat v2 中那样？

在 Seurat v2 中，我们还使用 ScaleData() 函数从单细胞数据集中删除不需要的变异源。例如，我们可以“regress out”与细胞周期阶段或线粒体污染相关的异质性。Seurat v3 中的 ScaleData() 仍然支持这些功能，即：

pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")

但是，特别是对于想要使用此功能的高级用户，我们强烈建议使用新的归一化工作流程 SCTransform()。我们的论文中描述了该方法，此处使用 Seurat v3 提供了一个单独的小插图。与 ScaleData() 一样，函数 SCTransform() 也包含 vars.to.regress 参数。

6 执行线性降维

接下来我们对标准化后的数据执行 PCA。默认情况下，仅将先前确定的变量特征用作输入，但如果您希望选择不同的子集，则可以使用 features 参数进行定义。

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

Seurat 提供了几种有用的方法来可视化定义 PCA 的细胞和特征，包括 VizDimReduction()、DimPlot() 和 DimHeatmap()

# 通过几种不同的方式检查和可视化 PCA 结果
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)

## PC_ 1 
## Positive:  CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL 
## Negative:  MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2 
## PC_ 2 
## Positive:  CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1 
## Negative:  NKG7, PRF1, CST7, GZMB, GZMA 
## PC_ 3 
## Positive:  HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1 
## Negative:  PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11 
## PC_ 4 
## Positive:  HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1 
## Negative:  VIM, IL7R, S100A6, IL32, S100A8 
## PC_ 5 
## Positive:  GZMB, NKG7, S100A8, FGFBP2, GNLY 
## Negative:  LTB, IL7R, CKB, VIM, MS4A7

VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")

DimPlot(pbmc, reduction = "pca")

特别是 DimHeatmap() 允许轻松探索数据集中异质性的主要来源，并且在尝试决定要包括哪些 PC 以进行进一步的下游分析时非常有用。细胞和特征都根据其 PCA 分数排序。将 cells 设置为一个数字会绘制光谱两端的“极端”细胞，这会显着加快大型数据集的绘制速度。虽然显然是监督分析，但我们发现这是探索相关特征集的宝贵工具。

DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE)

DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)

7 确定数据集的维度

为了克服 scRNA-seq 数据的任何单一特征中广泛的技术噪音，Seurat 根据其 PCA 分数对细胞进行聚类，每个 PC 本质上代表一个“metafeature”，它结合了相关特征集的信息。因此，顶级主成分代表了数据集的强大压缩。但是，我们应该选择包含多少个成分？10？20？100？

在 Macosko et al 文章中，我们实施了受 JackStraw 程序启发的重采样测试。我们随机排列数据的一个子集（默认为 1%）并重新运行 PCA，构建特征分数的“null distribution”，然后重复此过程。我们将“重要”PC 识别为具有低 p-value 特征的大量丰富的 PC。

# 注意：对于大数据集，此过程可能需要很长时间，为了方便起见，请注释掉。更多的近似技术，例如在 ElbowPlot() 中实现的技术，可用于减少计算时间
pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)

JackStrawPlot() 函数提供了一个可视化工具，用于将每个 PC 的 p-value 分布与均匀分布（虚线）进行比较。“显着”PCs 将显示具有低 p-value（虚线上方的实线）的特征的强烈富集。在这种情况下，似乎在前 10-12 个 PCs 之后显着性急剧下降。

JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)

另一种启发式方法生成“Elbow plot”：根据每个主成分解释的方差百分比（ElbowPlot() function）对主成分进行排名。在此示例中，我们可以在 PC9-10 周围观察到一个“elbow”，这表明大部分真实信号是在前 10 个 PC 中捕获的。

ElbowPlot(pbmc)

识别数据集的真实维度——对用户来说可能具有挑战性/不确定性。因此，我们建议考虑这三种方法。第一个是更有监督的，探索 PCs 以确定相关的异质性来源，并且可以与 GSEA 结合使用。第二种实现基于随机空模型的统计检验，但对于大型数据集来说很耗时，并且可能无法返回明确的 PC cutoff。第三种是常用的启发式算法，可以立即计算。在此示例中，所有三种方法都产生了相似的结果，但我们可能有理由选择 PC 7-12 之间的任何值作为 cutoff。

我们在这里选择了 10，但鼓励用户考虑以下几点：

• Dendritic cell 和 NK aficionados 可能认识到与 PC 12 和 13 密切相关的基因定义了罕见的免疫亚群 (i.e. MZB1 is a marker for plasmacytoid DCs)。然而，这些群体非常罕见，在没有先验知识的情况下，很难将它们与这种规模的数据集的背景噪声区分开来。
• 我们鼓励用户使用不同数量的 PCs（10,15,or even 50！）重复下游分析。正如您将观察到的，结果通常不会有显着差异。
• 我们建议用户在选择更大的值。例如，仅使用 5 个 PCs 执行下游分析会对结果产生重大不利影响。

8 细胞聚类

Seurat v3 应用基于图的聚类方法，建立在 (Macosko et al) 的初始策略之上。重要的是，驱动聚类分析的距离度量（基于先前识别的 PC）保持不变。然而，我们将细胞距离矩阵划分为 clusters 的方法有了显着改进。我们的方法深受近期手稿的启发，这些手稿将基于图的聚类方法应用于 scRNA-seq 数据 [SNN-Cliq, Xu and Su, Bioinformatics, 2015] 和 CyTOF 数据 [PhenoGraph, Levine et al., Cell, 2015]。简而言之，这些方法将细胞嵌入到图结构中——例如 K-nearest neighbor(KNN) graph，在具有相似特征表达模式的细胞之间绘制边，然后尝试将该图划分为高度互连的“quasi-cliques”或“communities”。

与 PhenoGraph 一样，我们首先基于 PCA 空间中的欧几里得距离构建 KNN 图，并根据其局部邻域中的共享重叠（Jaccard similarity）细化任意两个单元之间的边权重。此步骤使用 FindNeighbors() 函数执行，并将先前定义的数据集维度（前 10 个 PCs）作为输入。

为了对细胞进行聚类，我们接下来应用模块化优化技术，例如 Louvain 算法（默认）或 SLM [SLM, Blondel et al., Journal of Statistical Mechanics]，以迭代方式将细胞组合在一起，以优化标准模块化函数。FindClusters() 函数实现了这个过程，并包含一个分辨率参数，该参数设置下游聚类的“granularity”，增加的值会导致更多的聚类。我们发现将此参数设置在 0.4-1.2 之间通常会为大约 3K 细胞的单细胞数据集返回良好的结果。对于较大的数据集，最佳分辨率通常会增加。可以使用 Idents() 函数找到 clusters。

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)

## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
## 
## Number of nodes: 2638
## Number of edges: 95927
## 
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.8728
## Number of communities: 9
## Elapsed time: 0 seconds

# 查看前 5 个细胞的 cluster IDs
head(Idents(pbmc), 5)

## AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1 AAACCGTGCTTCCG-1 
##                2                3                2                1 
## AAACCGTGTATGCG-1 
##                6 
## Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8

9 运行非线性降维 (UMAP/tSNE)

Seurat 提供了多种非线性降维技术，例如 tSNE 和 UMAP，以可视化和探索这些数据集。这些算法的目标是学习数据的底层流形，以便将相似的细胞放在低维空间中。上面确定的基于图的 cluster 中的细胞应该在这些降维图上共同定位。作为 UMAP 和 tSNE 的输入，我们建议使用相同的 PCs 作为聚类分析的输入。

# 如果你还没有安装 UMAP，你可以通过 reticulate::py_install(packages = 'umap-learn')
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)

# 请注意，您可以设置 `label = TRUE` 或使用 LabelClusters 函数来帮助标记单个类群
DimPlot(pbmc, reduction = "umap")

您可以在此时保存该对象，以便可以轻松地将其加载回去，而无需重新运行上面执行的计算密集型步骤，或者可以轻松地与协作者共享。

saveRDS(pbmc, file = "pbmc_tutorial.rds")

10 寻找差异表达特征（cluster biomarkers）

Seurat 可以帮助您找到通过差异表达定义 clusters 的 markers。默认情况下，与所有其他细胞相比，它识别单个 cluster（specified in ident.1）的阳性和阴性标记。FindAllMarkers() 会针对所有 clusters 自动执行此过程，但您也可以测试 clusters 组之间的对比，或针对所有细胞进行测试。

min.pct 参数要求在两组细胞中以最小百分比检测到一个特征，而 thresh.test 参数要求一个特征在两组之间以一定数量差异表达（平均）。您可以将这两个设置为 0，但时间会急剧增加 - 因为这将测试大量不太可能具有高度差异性的功能。作为加速这些计算的另一种选择，可以设置 max.cells.per.ident。这将对每个身份类别进行下采样，使其中的细胞数量不超过设置的数量。虽然通常会出现功率损失，但速度可能会显着提高，并且差异表达最高的特征可能仍会上升到顶部。

# 寻找 cluster 2 的所有 markers
cluster2.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 2, min.pct = 0.25)
head(cluster2.markers, n = 5)
##             p_val avg_log2FC pct.1 pct.2    p_val_adj
## IL32 2.892340e-90  1.2013522 0.947 0.465 3.966555e-86
## LTB  1.060121e-86  1.2695776 0.981 0.643 1.453850e-82
## CD3D 8.794641e-71  0.9389621 0.922 0.432 1.206097e-66
## IL7R 3.516098e-68  1.1873213 0.750 0.326 4.821977e-64
## LDHB 1.642480e-67  0.8969774 0.954 0.614 2.252497e-63

# 寻找区分 cluster 5 与 cluster 0 和 3 的所有 markers
cluster5.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 5, ident.2 = c(0, 3), min.pct = 0.25)
head(cluster5.markers, n = 5)
##                       p_val avg_log2FC pct.1 pct.2     p_val_adj
## FCGR3A        8.246578e-205   4.261495 0.975 0.040 1.130936e-200
## IFITM3        1.677613e-195   3.879339 0.975 0.049 2.300678e-191
## CFD           2.401156e-193   3.405492 0.938 0.038 3.292945e-189
## CD68          2.900384e-191   3.020484 0.926 0.035 3.977587e-187
## RP11-290F20.3 2.513244e-186   2.720057 0.840 0.017 3.446663e-182

# 与所有剩余细胞相比，找到每个 cluster 的 markers，仅报告阳性的那些
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
pbmc.markers %>%
    group_by(cluster) %>%
    slice_max(n = 2, order_by = avg_log2FC)

## # A tibble: 18 × 7
## # Groups:   cluster [9]
##        p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene    
##        <dbl>      <dbl> <dbl> <dbl>     <dbl> <fct>   <chr>   
##  1 9.57e- 88       1.36 0.447 0.108 1.31e- 83 0       CCR7    
##  2 3.75e-112       1.09 0.912 0.592 5.14e-108 0       LDHB    
##  3 0               5.57 0.996 0.215 0         1       S100A9  
##  4 0               5.48 0.975 0.121 0         1       S100A8  
##  5 1.06e- 86       1.27 0.981 0.643 1.45e- 82 2       LTB     
##  6 2.97e- 58       1.23 0.42  0.111 4.07e- 54 2       AQP3    
##  7 0               4.31 0.936 0.041 0         3       CD79A   
##  8 9.48e-271       3.59 0.622 0.022 1.30e-266 3       TCL1A   
##  9 5.61e-202       3.10 0.983 0.234 7.70e-198 4       CCL5    
## 10 7.25e-165       3.00 0.577 0.055 9.95e-161 4       GZMK    
## 11 3.51e-184       3.31 0.975 0.134 4.82e-180 5       FCGR3A  
## 12 2.03e-125       3.09 1     0.315 2.78e-121 5       LST1    
## 13 3.13e-191       5.32 0.961 0.131 4.30e-187 6       GNLY    
## 14 7.95e-269       4.83 0.961 0.068 1.09e-264 6       GZMB    
## 15 1.48e-220       3.87 0.812 0.011 2.03e-216 7       FCER1A  
## 16 1.67e- 21       2.87 1     0.513 2.28e- 17 7       HLA-DPB1
## 17 1.92e-102       8.59 1     0.024 2.63e- 98 8       PPBP    
## 18 9.25e-186       7.29 1     0.011 1.27e-181 8       PF4

Seurat 有几个差异表达测试，可以使用 test.use 参数设置（有关详细信息，请参阅我们的 DE vignette）。例如，ROC 测试返回任何单个标记的“分类能力”（范围从 0-random 到 1-perfect）。

cluster0.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 0, logfc.threshold = 0.25, test.use = "roc", only.pos = TRUE)

我们包括几个用于可视化标记表达的工具。VlnPlot()（显示跨 clusters 的表达概率分布）和 FeaturePlot()（在 tSNE 或 PCA 图上可视化特征表达）是我们最常用的可视化。我们还建议探索 RidgePlot()、CellScatter() 和 DotPlot() 作为查看数据集的其他方法。

VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))

# you can plot raw counts as well
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)

FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", "CD8A"))

DoHeatmap() 为给定的细胞和特征生成一个表达式热图。在这种情况下，我们为每个 cluster 绘制前 20 个 markers（或所有 markers，如果少于 20 个）。

pbmc.markers %>%
    group_by(cluster) %>%
    top_n(n = 10, wt = avg_log2FC) -> top10
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()

11 将细胞类型标识分配给类群

幸运的是，对于这个数据集，我们可以使用规范标记轻松地将无偏聚类与已知细胞类型相匹配：

new.cluster.ids <- c("Naive CD4 T", "CD14+ Mono", "Memory CD4 T", "B", "CD8 T", "FCGR3A+ Mono", "NK", "DC", "Platelet")
names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
pbmc <- RenameIdents(pbmc, new.cluster.ids)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()

saveRDS(pbmc, file = "pbmc3k_final.rds")