#wget -c ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/geo/series/GSE48nnn/GSE48213/suppl/GSE48213_RAW.tar
#tar -xf GSE48213_RAW.tar
#gzip -d *.gz
## 首先在GSE48213_RAW目录里面生成tmp.txt文件，使用shell脚本
# awk '{print FILENAME"\t"$0}' GSM*.txt |grep -v EnsEMBL_Gene_ID >tmp.txt
数据准备
a=read.table('tmp.txt',sep = '\t',stringsAsFactors = F)
library(reshape2)
fpkm <- dcast(a,formula = V2~V1)
rownames(fpkm)=fpkm[,1]
fpkm=fpkm[,-1]
colnames(fpkm)=sapply(colnames(fpkm),function(x) strsplit(x,"_")[[1]][1])
library(GEOquery)
a=getGEO('GSE48213')
metadata=pData(a[[1]])[,c(2,10,12)]
datTraits = data.frame(gsm=metadata[,1],
cellline=trimws(sapply(as.character(metadata$characteristics_ch1),function(x) strsplit(x,":")[[1]][2])),
subtype=trimws(sapply(as.character(metadata$characteristics_ch1.2),function(x) strsplit(x,":")[[1]][2]))
)
save(fpkm,datTraits,file = 'GSE48213-wgcna-input.RData')
}
按照健明老师的公众号，进行数据准备
step2:确定最佳beta值
选择合适“软阀值（soft thresholding power）”beta，同样的，也是使用教程标准代码即可：
powers = c(c(1:10), seq(from = 12, to=20, by=2))
# Call the network topology analysis function
sft = pickSoftThreshold(datExpr, powerVector = powers, verbose = 5)
#设置网络构建参数选择范围，计算无尺度分布拓扑矩阵
# Plot the results:
##sizeGrWindow(9, 5)
par(mfrow = c(1,2));
cex1 = 0.9;
# Scale-free topology fit index as a function of the soft-thresholding power
plot(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Scale Free Topology Model Fit,signed R^2",type="n",
main = paste("Scale independence"));
text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
labels=powers,cex=cex1,col="red");
# this line corresponds to using an R^2 cut-off of h
abline(h=0.90,col="red")
# Mean connectivity as a function of the soft-thresholding power
plot(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5],
xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Mean Connectivity", type="n",
main = paste("Mean connectivity"))
text(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], labels=powers, cex=cex1,col="red")
关键就是理解pickSoftThreshold函数及其返回的对象，最佳的beta值就是sft$powerEstimate
参数beta取值默认是1到30，上述图形的横轴均代表权重参数β，左图纵轴代表对应的网络中log(k)与log(p(k))相关系数的平方。相关系数的平方越高，说明该网络越逼近无网路尺度的分布。右图的纵轴代表对应的基因模块中所有基因邻接函数的均值。最佳的beta值就是sft$powerEstimate，已经被保存到变量了，不需要知道具体是什么，后面的代码都用这个即可，在本例子里面是6。
即使你不理解它，也可以使用代码拿到合适“软阀值（soft thresholding power）”beta进行后续分析。
step3：一步法构建共表达矩阵
有了表达矩阵和估计好的最佳beta值，就可以直接构建共表达矩阵了。
net = blockwiseModules(
datExpr,
power = sft$powerEstimate,
maxBlockSize = 6000,
TOMType = "unsigned", minModuleSize = 30,
reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,
numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,
saveTOMs = F,
verbose = 3
)
table(net$colors)
所有的核心就在这一步，把输入的表达矩阵的几千个基因组归类成了几十个模块。大体思路：计算基因间的邻接性，根据邻接性计算基因间的相似性，然后推出基因间的相异性系数，并据此得到基因间的系统聚类树。然后按照混合动态剪切树的标准，设置每个基因模块最少的基因数目为30。
根据动态剪切法确定基因模块后，再次分析，依次计算每个模块的特征向量值，然后对模块进行聚类分析，将距离较近的模块合并为新的模块。
step4: 模块可视化
这里用不同的颜色来代表那些所有的模块，其中灰色默认是无法归类于任何模块的那些基因，如果灰色模块里面的基因太多，那么前期对表达矩阵挑选基因的步骤可能就不太合适。
# Convert labels to colors for plotting
mergedColors = labels2colors(net$colors)
table(mergedColors)
# Plot the dendrogram and the module colors underneath
plotDendroAndColors(net$dendrograms[[1]], mergedColors[net$blockGenes[[1]]],
"Module colors",
dendroLabels = FALSE, hang = 0.03,
addGuide = TRUE, guideHang = 0.05)
## assign all of the gene to their corresponding module
## hclust for the genes.
这里的重点就是plotDendroAndColors函数，它接受一个聚类的对象，以及该对象里面包含的所有个体所对应的颜色。比如对表达矩阵进行hclust之后，加上表达矩阵里面所有样本的分组信息对应的颜色，也是可以用plotDendroAndColors函数可视化的，比如下面的样品图：
#明确样本数和基因数
nGenes = ncol(datExpr)
nSamples = nrow(datExpr)
#首先针对样本做个系统聚类树
datExpr_tree<-hclust(dist(datExpr), method = "average")
par(mar = c(0,5,2,0))
plot(datExpr_tree, main = "Sample clustering", sub="", xlab="", cex.lab = 2,
cex.axis = 1, cex.main = 1,cex.lab=1)
## 如果这个时候样本是有性状，或者临床表型的，可以加进去看看是否聚类合理
#针对前面构造的样品矩阵添加对应颜色
sample_colors <- numbers2colors(as.numeric(factor(datTraits$Tumor.Type)),
colors = c("white","blue","red","green"),signed = FALSE)
## 这个给样品添加对应颜色的代码需要自行修改以适应自己的数据分析项目。
# sample_colors <- numbers2colors( datTraits ,signed = FALSE)
## 如果样品有多种分类情况，而且 datTraits 里面都是分类信息，那么可以直接用上面代码，当然，这样给的颜色不明显，意义不大。
#构造10个样品的系统聚类树及性状热图
par(mar = c(1,4,3,1),cex=0.8)
plotDendroAndColors(datExpr_tree, sample_colors,
groupLabels = colnames(sample),
cex.dendroLabels = 0.8,
marAll = c(1, 4, 3, 1),
cex.rowText = 0.01,
main = "Sample dendrogram and trait heatmap")
上面给样本进行聚类的代码可以不运行，其实跟WGCNA本身关系不大。
可以看到这些乳腺癌的细胞系的表达谱聚类情况并不是完全与其分类匹配，所以仅仅是根据样本的分组信息做差异分析并不完全准确。
后面的可视化网络需要在理解理解。
