题记：因为我们在准备烟草某些部位单细胞样品的时候，质量和活性总是比较低，所以对于比较难制备的样品，有的人推荐我们尝试一下snRNA-seq。就去了解了一下snRNA-seq。
https://isbscience.org/about/what-is-systems-biology/
单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的飞速发展使人们对组织中细胞种类、细胞的特殊状态有了深入认识。但是，scRNA-seq对于器官或者固体组织制备的细胞悬液的细胞活性和细胞数目有着较高的要求，这也意味着“躺在”超低温冰箱中的大量珍贵样本（脑组织，肿瘤组织等）都无法进行scRNA测序。而单细胞核RNA测序技术（snRNA-seq）的出现，则在很大程度上解决了以上问题。
虽然细胞核内的遗传物质可以大体代表整个细胞，然而，细胞质和细胞核之间的RNA类型和比例却存在一定的差异。RNA首先在细胞核内转录，并在细胞核内积累到稳定状态。在细胞质中， mRNA根据其出核率和不同的命运，包括转运到特定的亚细胞位置、核糖体的翻译、小RNA的降解等，达到不同的稳态水平。研究人员发现，细胞核RNA中含有大量的非编码序列，其中包含41%的基因间区序列和25%的内含子序列。同时，研究人员也发现有41.7%的转录本序列只在细胞核中存在。多项研究表明，内含子区域的reads增加了snRNA-seq的敏感性，并提高识别细胞类型的分辨率。因此，在处理单细胞核RNA测序数据时，纳入内含子序列具有重要意义。
目前单细胞转录组测序，还存在的主要缺陷：
应用范围受限：仅适用于新鲜组织样本，对于冻存样本，由于细胞已经丧失活性，因此无法开展scRNA-seq。
细胞转录偏好：解离过程会诱导应激基因的表达，引发细胞转录模式发生“人为改变”（artifactual transcriptional stress responses），造成转录偏好(bias)。这样获得的数据无法真实的反应样本的细胞转录状态，结果的可靠性大大降低。
细胞类型偏好：对于很多实体组织，如脑、心脏、肾脏等，蛋白酶倾向于将易于解离的细胞类型解离下来，因此会丢失不易解离的细胞；同时一些较为敏感的细胞可能会因为解离过度而破碎。这样，解离过程无法有效的获取到组织中的所有细胞类型，结果的准确性大为降低。
例如，在下面这个文章中作者发现“We could not detect expression of Fos and Socs3 in cryosections; however, we could detect Fosin SCs that had undergone dissociation, which demonstrated that the SCisolation procedure induces Fos expression in subpopulation of the SCs” 。也就是说通过单细胞发现的有些marker基因可能并不是真正的，例如Fos等基因的表达量上调可能是解离过程引起的“人为偏差”。
下面这个研究利用snRNA-seq对小鼠纤维化肾脏细胞进行探索，结果发现snRNA-seq在成人肾脏中实现了与scRNA-seq相似的基因检测，而且它还有很多优势，包括减少解离偏差，与冷冻样本兼容，消除解离诱导的转录应激反应，以及成功用于炎症纤维化肾脏。
加州大学则成功的将snRNA-seq应用于人类冻存脑细胞组织样本。
而就植物单细胞研究而言，相比动物起步慢，也更困难。
植物细胞被固定在刚性细胞壁基质中，分离单细胞时需要将其移除；
植物细胞壁的酶消化是一种重要的胁迫源，容易刺激植物细胞出现应激反应，诱导压力应答基因的表达，人为引入转录偏差；
植物原生质体大小存在可变性（渗透压导致的原生质体胀大）；
质体细胞器、和液泡中存在可与RNA相互作用的次级代谢物；
不同组织类型间适用的酶组合不同，需要优化消化细胞壁所需的酶；
制备的原生质体很脆弱，活性波动大。
所以现在很多人提出，植物开展单细胞核测序，可能可以较好地克服上述困难。
最近发表的植物单细胞的文章，也越来越多的人采用了snRNA-seq。
茎尖分生组织和早期叶片原基具有复杂的细胞结构，该结构由嵌入不同组成的细胞壁中的异质细胞组成。制备原生质体，需要长时间的酶消化。异位激活和随机基因的表达与原生质体形成相关。在这个研究中，为了评估原生质体对基因表达的影响，他们试图检测拟南芥叶片和叶肉原生质体中的基因表达，并观察到频繁的异位激活。例如，WOX2未在叶子中表达。追踪了10,000多个原生质体，观察到超过21％的原生质体表达了WOX2。该观察结果强烈暗示通过原生质体化存在基因表达的异位随机激活。
所以，这个文章采用了细胞核提取的方法，得到正常形态的番茄茎尖分生组织的细胞核，进行snRNA-seq 。经过质量控制和过滤，获得了13377 个核，检测到基因数为21402 。为了评估snRNA-seq数据的可重复性和敏感性， 这个文章同时用番茄茎尖进行 Bulk RNA-seq 。snRNA-seq检测到的基因，有92.3% 可以通过Bulk RNA-seq 检测到（FPKM > 1 ），表明snRNA-seq 具有较高的敏感性，snRNA-seq和Bulk RNA-seq 的相关性达到0.9 ，表明具有很高的重现性。后面的分析就和常规scRNA-seq的分析类似了。
德国的团队同样的，在分析单细胞数据前，进行了独立的bulk RNA-seq实验来识别原生质体分离（protoplast isolation，PI）应答基因，然后将它们从scRNA-seq分析中剔除。发现无论剔除PI应答基因前后，PI诱导的影响均存在。
以上数据体现了植物单细胞核测序的技术性能，与单细胞测序相比，细胞核测序在得到高质量数据的同时也让研究者不再受困于原生质体制备，能够推动植物单细胞研究。但是我们可能还是会首选scRNA-seq，毕竟snRNA-seq会丢失细胞质中的转录信息。对于实在不理想组织，的可能会考虑采取snRNA-seq。
本文使用 文章同步助手 同步
