Nat Biotech丨碱基编辑传感器库高通量识别癌症相关突变

原创 珍奇 图灵基因 

收录于话题#前沿分子生物学技术

撰文：珍奇

IF：54.908

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亮点：

本文描述了一个基于传感器的多功能碱基编辑（BE）平台，该平台能够从跨多个物种、细胞系和碱基编辑器配置的大型池库中识别有效的单向导RNA（sgRNA）。作者表明，传感器预测可以加速体内癌症相关 SNV 的表征，并证明集成BE传感器可以支持对 BE基因筛选的解释。

碱基编辑可用于表征功能未知的单核苷酸变体，但定义sgRNA和碱基编辑器的有效组合仍然具有挑战性。2022年2月14日，《Nature Biotechnology》杂志发表了一篇名为“Base editing sensor libraries for high-throughput engineering and functional analysis of cancer-associated single nucleotide variants”的文章。本文描述了模块化碱基编辑活动“传感器”，它将 sgRNA 和顺式中的同源靶位点连接起来，并使用它们系统地测量数千个与功能不同的碱基编辑器配对的 sgRNA 的编辑效率和精度。通过对超过 200,000 个编辑器-sgRNA 组合的传感器编辑进行量化，他们提供了全面的 sgRNA 资源，用于在多个模型系统中引入与癌症相关的单核苷酸变体，并预计该框架将有助于在细胞和动物模型中对癌症变体进行功能性研究。

基因组测序研究揭示了癌症相关突变的复杂、异质混合，包括已知的和可药用的致癌突变以及大量不确定意义的变体（VUS）。了解特定致癌突变的影响需要进行功能分析。即使是癌症相关单核苷酸变异体 (SNV) 的细微变化也会对肿瘤发生和药物敏感性产生重要的功能影响。因此，虽然 DNA 测序具有支持临床决策的巨大潜力，但由于缺乏对特定变异如何导致疾病的了解而受到限制。为了帮助开发未来以突变为中心的传感器库，本文作者开发了一个灵活的计算管道，他们预计此方法将加速阐明 VUS 的功能。为了以高通量方式测量单个 sgRNA 的活性，他们设计了一种 BE 传感器，其中 sgRNA 连接到慢病毒载体中的同源靶位点，允许通过 PCR 扩增和测序对编辑效率进行高通量测量传感器盒，数据表明 BE 传感器库可靠地报告了特征良好的碱基编辑器的已知特征。

为了建立灵活的管道以促进由临床基因组学数据驱动的 BE 筛选，他们开发了一种 BE sgRNA 设计算法——AMINEsearch。他们首先使用AMINEsearch 来生成传感器库，以对源自靶向测序数据 (MSK-IMPACT)的癌症相关突变进行建模，在库生成时深度覆盖超过 21,000 个肿瘤中的 462 个癌症相关基因。BE 非常适合创建与癌症相关的改变，因为这种改变高度富集 CtoT 到 GtoA 的转换突变。大多数与BE兼容的SNV是错义突变，其次是无义和剪接位点改变。

为了模拟小鼠基因组中与癌症相关的突变，他们在 AMINEsearch 工作流程中包括了进一步的步骤，以识别直系同源小鼠位点。由于缺乏序列保守性，他们注意到当靶向小鼠基因组时 BE sgRNA 会有适度损耗。可用 BE 工具的多样性允许进行不同的权衡。例如，使用具有扩展编辑窗口 (F2X) 或 PAM 灵活性 (FNLS-NG) 的碱基编辑器以降低局部特异性，或可能增加全局脱靶的预期成本增加理论覆盖率效果。

为了测量 HBES 和 MBES 文库中 sgRNA 的编辑效率，他们将每一个一式两份转导到表达三种碱基编辑器之一的 MDA-MB-231 细胞中：FNLS10（最高编辑效率）、F2X10（扩展编辑范围）或 FNLS- NG12,14（PAM 灵活性）。正如预期的那样，FNLS 和 F2X 在 NGG PAM 上具有最高的编辑效率，而 FNLS-NG 在 NGN PAM上表现出广泛的活性。为了确定在一个细胞系中鉴定的传感器编辑分数是否可以外推到其他细胞类型，他们在另外四种细胞系中重复了 HBES 和 MBES 筛选。数据表明，可以使用 BE 传感器分析来预测单个 sgRNA 在不同细胞系统中的相对效力。

为了直接测试 BE 传感器评分预测内源性靶点活性的程度，他们测量了 12 个独立基因组位点的编辑，其中包含 13 个 sgRNA，这些 sgRNA 在传感器分析中显示出高度编辑。使用 FNLS 或 AncBE4max，内源性编辑与基于传感器的估计很好地对齐，超过50% 的病例（7/13）在传感器报告效率的 10% 以内。为了探究BE传感器分数是否可以预测给定一系列可能选项的目标编辑的相对效率，他们将 TP53 中的 R213 位点与一系列七个 sgRNA 平铺。在这种情况下，他们使用 F2X 碱基编辑器来允许在该系列中的广泛目标位置（5-11bp）进行编辑。与上述数据一致，传感器估计与内源性基因座的编辑非常相似。总之，这些数据表明，BE 传感器编辑与内源性位点的编辑密切相关，从而可以在多种生物环境中可靠地识别具有高编辑效率的 sgRNA。

癌症中由APOBEC 驱动的突变特征包括转换（C > T）和颠换（C>G）。含有rAPOBEC1 的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 可以在某些情况下诱导 C > G 突变。可以利用这种“非规范”颠换编辑来增加可以使用 BE 建模的突变的广度。他们接下来研究了影响C > R 编辑结果的序列特征，虽然 MDA-MB-231 和 PC9 细胞显示出频繁和高水平的颠换编辑，但 NIH3T3、PDEC 和 KPT1 细胞的 C>R 改变频率非常低。他们开发了一种慢病毒 BE 报告基因，它在目标 C>G 编辑后驱动 GFP 诱导。该构建体准确地报告了细胞 C>G 编辑偏差，显示 MDA-MB-231、PC9 和 HCC1806 中的有效 C>G 诱导，但不是 NIH3T3 或 PANC1，与传感器测量一致。因此，颠换编辑偏倚并不是人类癌细胞的普遍特征。使用该报告者的系统研究可以提供对决定这一活动的机制的深入了解。

基于传感器的验证的一个主要优点是能够识别产生特定错义突变的活性 sgRNA，几乎没有附带编辑。此类指南可用于询问特定突变在体外和体内的影响。作为概念验证，他们专注于 TP53 肿瘤抑制基因，它是癌症中最常发生突变的基因，并显示出显着的突变异质性。因此，BE-sensor 验证的 sgRNA 可用于在体内实验系统中同步设计源自患者的内源性突变，从而促进癌症和其他疾病的系统变异表型研究。

上述实验证明了 BE 传感器验证的 sgRNA 在体内检测癌症变体的稳健性。随后他们着手测试 BE 传感器库是否可以与高通量筛选方法相结合，以对癌症相关的 SNV 进行大规模并行功能检测。筛选 BE 传感器库的一个优点是细胞应该在传感器模块和内源性目标位点进行编辑。因此，对细胞表型的变异特异性影响可以与传感器目标位点的编辑精度和效率相关联，从而最大限度地减少误报。从理论上讲，这种方法还应该识别编辑其目标但不诱导表型效应的 sgRNA。为了测试这个概念，他们用 MBES 文库在低感染复数和 >1,000× 表示下转导了 KrasG12D/+；Trp53WT/WT FNLS-PDEC。大多数富集的sgRNA 显示出相对较高的传感器编辑，但值得注意的是，Trp53-R213 sgRNA 在屏幕上显示出超过 10 倍的富集，尽管传感器目标编辑不到 3%。对同源传感器盒的检查显示，该 sgRNA 在相邻胞嘧啶处显示出高水平的编辑，产生了 T211I 突变——在人类癌症中也观察到了一种变体 16,30。移植了 Trp53T208I 细胞（对应于人类 TP53T211I）的小鼠死于完全外显性疾病（中位生存期为 53 天）。大块肿瘤组织gDNA的测序分析证实了C>T（Trp53T208I）突变，在R210的胞嘧啶处编辑<15％C>T（对应于人TP53R213），暗示T208I是致癌的在这种情况下的驱动程序。这些数据将多个 TP53错义突变确定为非转化胰腺上皮细胞增殖的驱动因素，并将 Trp53T208I/TP53T211I确定为该胰腺癌小鼠模型中真正的驱动突变。

教授介绍： 

Lukas E. Dow，康内尔大学医学院副教授。他的团队主要通过使用体内动物模型系统和离体器官型培养物研究结直肠癌的发生、进展和反应。他们与纪念斯隆凯特琳癌症中心和冷泉港实验室的实验室合作，率先开发了用于动物研究的下一代技术，例如基于调节miRNA的shRNA和CRISPR / Cas9基因组编辑。他们使用这些工具根据在人类结直肠癌（CRC）中经常观察到的遗传改变生成量身定制的临床前模型，并对遗传背景和局部环境线索（如炎症）如何影响CRC的发病、进展和治疗反应进行研究。他们的目标是通过定义癌症的关键驱动因素设计更有效的患者治疗策略。

参考文献：

Sánchez-Rivera, F.J., Diaz, B.J., Kastenhuber, E.R.et al.Baseediting sensor libraries for high-throughput engineering and functionalanalysis of cancer-associated single nucleotide variants.NatBiotechnol(2022). https://doi.org/10.1038/s41587-021-01172-3