实验第一步，设计实验！
不同的实验方法需要设计的实验分组也是不一样哒，常见的几种分组简单整理如下哦~
通常情况下，每组实验至少需要设置 3-5 个平行，减少实验误差。
注意：以上是常规的分组思路，一些特殊实验方法可能需要设置更多的分组 (如LDH 细胞活力检测)，实验开始前详细阅读产品说明书或实验 Protocol 是一个好习惯哦！
实验设计好了，要开始实验了，检查一下我们的试剂/仪器准备好了吗？
细胞系、基础培养基、血清、抗生素，有条件的小伙伴也可以直接购买完全培养基哦~
96 孔板、细胞活力检测试剂、无菌枪头、无菌离心管、无菌水、无菌 PBS 等。
酶标仪。
一切准备就绪，我们来进行细胞复苏吧~
【细胞复苏】
取一支冻存细胞，在 37℃ 水浴中快速解冻。迅速转移至 10 mL 完全培养基中，800 rpm 3 min 常温离心收集细胞，细胞沉淀用完全培养基重悬，接种于培养皿中，并置于 37℃，5% CO2培养箱培养。(更多细胞复苏 tips，请参考往期推文：干货分享 | 细胞冻存与复苏避坑指南)
注意: 不同冻存液细胞复苏可能有差异，还是那句话，实验开始前要详细阅读产品说明书或实验 Protocol！
找一个合适的时间，看看我们的细胞是不是乖乖长大了？ 嗯~长得还不错 ，进行预实验来判断一下最佳接种细胞量以及试剂使用量吧~
【对数期细胞收集】
细胞生长至对数期时收集细胞，使用细胞计数板计数。
【调整细胞密度】
使用 96 孔板时每孔加入 100 μL 细胞混悬液，设置 5-7 个细胞密度梯度，每个细胞密度设置 3-5 个复孔，确定检测试剂所需最佳细胞密度。
啥都准备好了，废话不说，我们上实验！
【正式实验】：根据预实验结果接种细胞，置于 37℃，5% CO2培养箱培养。
【配制药物母液】：按照需要的实验药物浓度合理配制药物母液，使用时稀释母液即可。
【加药】：每孔加入相同体积不同浓度的药物，设置药物处理时间为 12 h、24 h、36 h、48 h 等。
【检测】：药物处理后选择合适的方法进行细胞活力检测。
▐ 1. CCK-8 检测
基于 WST-8 检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测法，主要用于细胞活性检测。
检测原理：WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可被线粒体内的一些脱氢酶还原成 Formazan (橙黄色)。CCK-8 为预混溶液，即开即用。
具体操作如下：
1） 96 孔板中每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡)；
2） 培养箱培养 1-4 h (避免放在培养箱边缘位置)；
3） 酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。
图 1. KN93 和 Gemcitabine 对 CCLP1 细胞活力影响[1]。
CCK-8 检测细胞活力发现 KN93 可以增强 Gemcitabine 对 CCLP1 的敏感性。
▐ 2. Cell-ATP 检测
也叫做CTG 检测，基于高灵敏度生物发光检测技术，通过对 ATP 进行定量以测定培养物中活细胞数目及细胞活力。
检测原理：荧光素酶以荧光素、三磷酸腺苷 (ATP) 和 O2为底物，在 Mg2+存在时，可将化学能转化为光能。在荧光素酶催化的发光反应中，ATP 在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。此方法不受化合物自发荧光的影响。
具体操作如下：
1) 取出细胞培养板，室温平衡 10 min;
2) 96 孔板中每孔直接加入 100 μL Cell-ATP 检测试剂;
3) 室温振荡混匀 2 min，以促进细胞充分裂解;
4) 室温孵育 10 min (可根据预实验结果调整孵育时间)，使发光信号趋于稳定;
5) 使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光测定 (检测参数可根据仪器类型及检测灵敏度适当调整)。
图 2. SIPL1 对 TNBC 细胞活力的影响[2]。
CCK-8 (a) 和 CTG 发光细胞活力测定 (b) 用指示载体转导 BT-549 和 MDA-MB-231 细胞增殖能力的分析。
▐ 3. LDH 检测
乳酸脱氢酶 (Lactate dehydrogenase, LDH) 检测试剂盒可以在细胞膜完整性丧失进而细胞浆内酶释放时检测细胞损伤。
检测原理：在 LDH 的作用下，乳酸被氧化成丙酮酸 (Pyruvate), NADH 和 INT 被硫辛酰胺脱氢酶催化反应生成 NAD+和 Formazan。此方法与 CCK-8 联用可以用于死、活细胞的同步检测。
具体操作如下：
注意：此方法需要设置高对照组，即在培养基中加入10 μL Lysis Solution。
间接检测法：
1) 药物处理细胞后，从 96 孔板每孔吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震荡混匀；
2) 室温避光孵育 30 min；
3) 每孔加入 50 μL Stop Solution ，酶标仪测定 490 nm 处的吸光度。
直接检测法：
1) 96 孔板每孔吸弃 50 μL 培养基上清，以剩余培养基及细胞作为检测对象，每孔加入 50 μL Working Solution，震荡混匀；
2) 室温避光孵育 30 min；
3) 每孔加入 50 μL Stop Solution，酶标仪测定 490 nm 处的吸光度。
图 3. OMVs 对 THP-1 细胞活力的影响[3]。
LDH 检测发现内源性 OMVs 不能诱导细胞焦亡及 Caspase-1 的活化。
在细胞活力检测实验中，常见的数据分析方法是分析药物处理前后 OD 值的变化，小 M 也为您整理了几种方法~
▐ 1. 细胞接种有什么要注意的吗？
细胞接种时需要注意96 孔板外圈不宜做实验用途，可以用无菌水填满，避免培养导致的边缘效应。
▐ 2. 对数期细胞怎么确定？
每种细胞的倍增时间不一样，在养细胞初期，可以做细胞的生长曲线来确认细胞的倍增时间，根据细胞倍增时间推测达到对数生长期的时间。也可以在细胞汇合度达到 80% 左右时收集细胞进行接种。
▐ 3. 接种细胞数量怎么确定？
接种的细胞用于后续实验，可根据药物培养时间及细胞翻倍速度来确定接种数量。
▐ 4. 每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
1）当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基或无菌水，不作为测定孔用。
2）有可能会因为 CCK-8 挂壁而产生误差，建议在加入 CCK-8 后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。
3）每孔的细胞数量过多或过少，请预先在 1,000～100,000 个/孔范围内摸索条件。
▐ 5. 哪些物质会影响 CCK-8 的测定？
当有还原性物质存在时会影响 CCK-8 的测定 (含有维生素 C 的 Glucose 等)。一般培养基中的酚红或血清不影响测定。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定结果，扣除空白吸收即可。
▐ 6. 在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？
可以缩短加入 CCK-8 后的培养时间。例如：可以把加入 CCK-8 试剂后的培养时间由 2 h 缩短为 1 h。
▐ 7. CCK-8 对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入 CCK-8 培养 1-4 h 吸光度已经很高，但悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长孵育时间或增加细胞数量来解决。
▐ 8. 应该每次做标准曲线吗？
虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
▐ 9. CCK-8 能否检测细菌细胞？
可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。具体操作：向 100 μLE.coli培养液中加入10 μL CCK-8 溶液，并培养 1-4 h 或过夜，再进行吸光度测定。
[1] Fu Y, et al. Alpha5 nicotine acetylcholine receptor subunit promotes intrahepatic cholangiocarcinoma metastasis. Signal Transduct Target Ther. 2024 Mar 8;9(1):63.
[2] He J, et al. SIPL1, Regulated by MAZ, Promotes Tumor Progression and Predicts Poor Survival in Human Triple-Negative Breast Cancer. Front Oncol. 2021 Dec 17;11:766790.
[3] Ye X, et al. Peptide MSI-1 inhibited MCR-1 and regulated outer membrane vesicles to combat immune evasion of Escherichia coli. Microb Biotechnol. 2023 Sep;16(9):1755-1773.
