1. COVID-19和IAV患者外周血PBMC单细胞转录图谱
图A：患者信息：3个HD，5个COVID19，2个IAV患者；COVID19和IAV各取了不同的时间点的样本（见图COVID-19有6个时间点，IAV有3个），一共送了23个样。
图B：23个样本的细胞数展示。过滤后得到46,022个细胞，平均每个样本约200细胞。⚠️其实仔细看样本间细胞数差挺大的，这个展示方式比较讨巧，至少看起来比较均一。
图C：细胞注释得到15个细胞群
T(CD3G+, CD4+/CD8A+/CD8B+)：naive T cells (CD3+CCR7+GZMA-), activated CD4+ T cells (CD3+CD4+IL7R+), cytotoxic CD8+ T cells (CD3+CD8+GZMA+), mucosal associated invariant T cells (MAIT cells; CD3+SLC4A10+), and cycling T cells (CD3+MKI67+)
B(MS4A1+)：naive B cells (MS4A1+IGHG1-), plasma cells (MZB1+IGHG1+), cycling plasma cells (MZB1+IGHG1+MKI67+TOP2A+), and memory B cells (CD27+MS4A1+IGHG1+)
Mono(LYZ+CD68+)
NK(KLRF1+XCL1+)
DC(CD1C+LYZ+)
megakaryocytes(PPBP)
stem cells(CD34)
图D：细胞群marker基因展示（这个图感觉画成气泡图或者堆叠条形图会更好）
2. 浆细胞在新冠和IAV患者的外周血中增加
图A：堆叠条形图展示23个样本15种细胞的比例变化
图B：浆细胞和细胞周期浆细胞在COVID-19和IAV感染患者中比例都明显增加，但这两种疾病之间的浆细胞比例没有显著性差别。浆细胞主要作用是产生抗体，其比例的增加可能会使中和抗体产生增多以保护机体。
图C：COVID-19的B细胞和HC的B细胞相比的上调基因的富集分析结果结果显示蛋白复合体组装和蛋白转运相关通路被显著富集。可能的原因是这个过程中大量蛋白质合成增加。此外还富集到了B细胞活化相关通路。（这里差异基因筛选的标准是adjusted p < 0.01, Foldchange > 2，还算是比较严格。看起来筛出的基因不多。富集分析是用ChIPseeker包做的：compareCluster (fun = "enrichGO,’’ pvalueCutoff = 0.1, pAdjustMethod = "BH,’’ OrgDb = "org.Hs.eg.db,ontBP’’) ）
图D：浆细胞的特性和功能依赖于转录因子PRDM1, XBP1和IRF4。和HC相比，COVID-19这三种转录因子的表达都显著增加。
❗️延伸：
PRDM1has a central role in determining and shaping the secretory arm of mature B cell differentiation and in promoting immunoglobulin (Ig) synthesis.
XBP1is a positively acting transcription factor in the CREB-ATF family that is expressed at a large amounts in plasma cells and is crucial for increasing protein synthesis in plasma cells.
IRF4regulates immunoglobulin class-switch recombination, and sustained and higher concentrations of IRF4 are known to promote the generation of plasma cells.
图E：激活的CD4+T细胞表达CD2AP和TNFSF14增加，细胞毒性CD8+T细胞表达TNFSF14和KDM5A增加，NK细胞表达KDM5A增加。
❗️延伸：
CD2AP是CD4+T细胞的接头分子，在病毒感染时参与滤泡辅助性T细胞Tfh的分化调节并促进保护性抗体的产生。
TNFSF14促进T细胞活化和外周血T细胞招募到组织。
KDM5A编码的H3K4me3脱甲基酶是NK细胞和T细胞活化所需。
总结：Taken together, these results demonstrated that elevated plasma cells and increased activation of T cells and NK cells in COVID-19 patients may contribute to defense against the virus.
这一部分的分析如D图和E图直接挑出某些分子查看表达逻辑性不强，这样做需要很多免疫学先验知识。
3. COVID-19患者的IFN反应和淋巴细胞凋亡
图A：对day1 COVID-19患者的T细胞、B细胞和NK细胞的高表达基因（和HC相比）进行功能富集，并展示了top20的富集通路。
⚠️：这里是把T, B, NK三种细胞的富集分析结果各选了前20个pathhway一起展示的。因为有重复的通路，所以展示了42条通路。可以借鉴❗️
response to type I IFN signaling和defense response to virus signaling在T, B, NK细胞中都被显著富集。此外，内质网和蛋白去折叠相关通路在B细胞中被显著富集。这可能是由于浆细胞比例增加，抗体合成旺盛所致。其他的信号通路包括染色体结构调节、DNA致密化改变等在SARS-CoV-2感染中也出现了上调。相关基因的功能值得进一步探究。
图B：day1 COVID-19患者的T细胞、B细胞、NK细胞、DC和单核细胞的高表达基因（和HC相比）的火山图显示，和富集分析结果中response to type I IFN signaling被显著富集相一致，对早期抗病毒起到关键作用的ISGs在多种细胞中都出现了显著高表达。在这些ISGs中，ISG15, IFI44L, MX1 和 X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)-associated factor 1 (XAF1)在T, B, NK, DC细胞群中都出现了上调。
图C：在bulk水平上进行比较，和HC相比，新冠患者样本中上述4个基因也出现了明显上调。
图D：随后作者将新冠患者从出现症状到出院人为分为了四个病程stage，并检测了这些差异基因在病程中的转录动态变化。结果得到6个时间依赖性表达模块。⚠️这里的时间动力学聚类分析是用Mfuzz做的。(见Mfuzz)
图E：对6个模块中的基因进行了通路富集分析以探究其生物学意义
Cluster 3包含158个基因，这些基因随着病程进展表达量逐渐降低。这些基因的功能富集显示它们主要与IFN反应相关，提示这些ISG相关基因的转录调控是动态变化的，它们在早期被激活以起到早期抗病毒作用，在晚期时间点表达活性逐渐降低。
Cluster 1包含38个基因，这些基因随着病程进展表达量逐渐增加。GO富集显示它们的功能主要与翻译和蛋白合成相关通路有关。这与随病程进展抗体合成增多相一致。
图F：HC和COV的CD4+T细胞部分基因表达情况显示TNFSF10 (TRAIL) 和它的受体TNFRSF10A在COV患者的T细胞中表达增加。另一个TNF通路成员TNFRSF1B在COV患者的T细胞也出现了表达上调。FAS, FASLG, 和FADD（FAS通路相关）也出现了上调。
4. COVID-19患者和IAV患者相比的免疫分子特征
图A：比较了HC、COVID-19和IAV患者的CD4+T细胞的因子、细胞因子受体和转录因子表达变化(NK细胞和DC细胞的结果见supplement)。聚类结果显示COVID-19患者的免疫细胞主要编码促炎细胞因子、细胞因子受体和IFN-反应性转录因子。而IAV患者，促炎转录因子和virus-interacting host factors出现明显高表达。
在IAV患者的多种免疫细胞中，和机体免疫反应相关的多种关键转录因子如STAT3, NFKB1和REL都出现了上调。NFKB1和REL编码NF-kB异二聚体的活性亚单位。激活NF-kB信号通路对于固有免疫和适应性免疫的调节具有重要作用。
在新冠患者的活化CD4阳性T细胞中，应对干扰素时激活的关键转录因子STAT3表达显著增加（其他细胞也增加，见supplement）。
图B：此前有研究显示STAT3信号通路的激活物IL-6和IL-10在IAV患者中高表达。图B显示和COVID-19和HC相比，HAV感染患者的活化的CD4+T细胞表达STAT3增加并且与time post admission相关。此外和其他组相比，HAV感染患者的活化的CD4+T细胞高表达RUNX3。既往文献报道RUNX3 induction是CD4+T细胞获得细胞毒性的关键步骤。
图C：STAT3和IRF3的表达在COVID-19中都增加，STAT3和NFkB表达在IAV中增加。
Hightlights
- We generated a single-cell atlas of PBMCs in both COVID-19 and influenza patients
- Plasma cells increase significantly in both COVID-19 and influenza patients
- COVID-19 is featured with XAF1-, TNF-, and FAS-induced T cell apoptosis
- COVID-19 activates distinct pathway (STAT1/IRF3) versus influenza (STAT3/NFkB)
