The pan-cancer landscape of crosstalk between epithelial-mesenchymal transition and immune evasion relevant to prognosis and immunotherapy response
与预后和免疫治疗反应有关的上皮-间质转化和免疫逃逸之间的泛癌景观
发表期刊：NPJ Precis Oncol
发表日期： 2021 Jun 22
doi:10.1038/s41698-021-00200-4
一、背景
上皮 - 间充质转化（EMT）是细胞的转化过程，其中它们从上皮形式过渡到间充质形式，这在胚胎发生和组织修复中起着关键作用。EMT还参与人类恶性肿瘤并推动癌症进展，在EMT过程中，癌细胞的凋亡受到抑制，这有利于诱导癌症干细胞，刺激血管生成，并增强肿瘤微环境的免疫抑制。此外，成功的 EMT 是在播散性肿瘤细胞和循环肿瘤细胞中观察到的共同特征，这有助于癌症的远处转移。
临床前和临床数据表明，EMT是治疗期间或治疗后的常见现象，治疗诱导的EMT意味着治疗耐药性和癌症进展。然而，对EMT与免疫疗法之间关系的研究是有限的，免疫疗法是一种有希望的癌症治疗策略，旨在增加浸润免疫溶解细胞的细胞溶解活性。
二、材料与方法
1 数据来源
1）从TCGA中获得了相关的多组学数据，包括表达谱、外显子测序数据和临床数据，这些数据来自17种不同类型的实体癌的8200个肿瘤
2）从Van Allen, Alexandra Snyder, Aleix Prat, Nadeem Riaz和Willy Hugo收集了五个用免疫阻断疗法（ICB）（抗PD-1/PD-L1或抗CTLA4治疗）治疗的独立免疫疗法数据集，其中包括对非小细胞肺癌（NSCLC）、HNSC、转移性黑色素瘤和转移性尿道癌（mUC）的治疗
3）从Charoentong收集了28种免疫细胞类型的327个转录组
4）癌细胞的转录组数据从癌症细胞系百科全书（CCLE）数据库下载
5）在2018年5月至2020年9月在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院接受肿瘤切除术的30名肺癌患者的肺癌组织
2 分析流程
1）EMT和免疫逃逸之间的免疫调节串扰的定量模型：MT特征得分是基于比较145个上皮标记基因和170个间质标记基因的表达；ECI得分>0的肿瘤（称为ECI高的肿瘤）被认为具有比基于相应CYT水平的预期更高的EMT特征，而ECI<0的肿瘤（称为ECI低的肿瘤）被认为具有比基于相应CYT水平的预期更低的EMT特征
2）肿瘤微环境中的免疫浸润：Cibersort
3）确定与EMT和免疫规避之间的免疫调节串联有关的癌细胞的分子和基因特征
4）免疫组化检测
5）统计学分析：通过基因集富集分析（GSEA）对17种不同癌症类型的标志通路进行富集；使用Cox比例风险模型分析了CYT依赖性和EMT依赖性的生存分析；通过ROC曲线评估肿瘤突变负荷（TMB）、EMT、CYT和ECI对免疫疗法反应的影响。
三、实验结果
01 - EMT和免疫逃逸之间的免疫调节串联的系统性分析
作者首先研究了泛癌中肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和EMT特征之间的关系，发现在17种癌症类型中存在明显的正相关（补充图1A）。然后测试了这种相关性是否混淆了癌症亚型的识别，发现TILs比例较高的癌症亚型表现出持续较高的EMT特征，尽管不同癌症亚型的TILs浸润水平存在明显的差异（图1A）。
细胞溶解免疫细胞是否与EMT特征相关以前尚未研究过，因此作者研究了与免疫细胞溶解活性（CYT）相关的潜在生物过程，该过程被用来评估免疫逃逸，使用GZMA和PRF1表达值的几何平均值。通过将每种癌症类型的肿瘤分为CYT high组和CYT low组，GSEA的结果显示，免疫相关途径和EMT过程在CYT high肿瘤中明显富集（图1B和补充图1B）。CYT high肿瘤倾向于表现出间质样表型，具有较高的EMT特征（补充图1C）。此外，观察到在17种类型的癌症中，间质标记基因始终与CYT呈正相关，而上皮标记基因通常与CYT呈负相关（图1C）。
作者系统地描述了17种不同癌症类型中免疫浸润的细胞组成与EMT特征的关系，发现大多数免疫细胞亚群的浸润与EMT评分呈正相关（图1D）。然后，组装了28个免疫细胞亚群和83个EMT相关生长因子的327个转录组，发现与癌细胞系相比，效应细胞亚群表达的生长因子与免疫抑制细胞相似（图1E）。在83个EMT相关生长因子中，观察到55个生长因子不仅在免疫细胞中显示出明显高于癌细胞系的表达，而且还显示出与EMT、CYT和TILs部分的强烈相关性（补充图1D）。例如，四种众所周知的诱导EMT的生长因子（TGFB1、HGF、BMP1和PDGFB），与其他免疫细胞和肿瘤细胞相比，在CD4/8+T细胞中表现出更高的表达水平（图1F和补充图1D），表明抗免疫逃逸也会通过产生诱导EMT的生长因子促进EMT。上述结果共同证明了免疫逃逸和EMT之间存在着泛癌相关性，并表明免疫效应细胞可能能够诱导EMT达到与免疫抑制细胞相似的程度。
02 - EMT和免疫逃逸之间的免疫调节串扰决定了癌症的预后
浸润免疫效应细胞一般与生存率的提高和对免疫疗法的反应有关，而EMT一般与不良后果和免疫抑制有关。以UCEC为例，CYT评分较高的肿瘤与较长的生存期有关，而EMT与较差的生存期有关（图2A），尽管在UCEC中CYT和EMT是相互正相关的。作者还在泛癌症水平上用荟萃分析法检验了上述观察结果，以充分利用不同的癌症类型，发现CYT分数与有利的结果明显相关，而EMT则与较差的生存率明显相关，尽管这两个因素之间存在正相关性。
观察两个与癌症结果呈负相关的正相关因素的困境表明，EMT和免疫逃逸之间的串扰可能比单独的免疫逃逸或EMT更具临床相关性。因此作者提出了一个ECI特征，对肿瘤微环境（TME）中免疫逃逸和EMT之间的串扰进行定量建模，根据肿瘤中相应的CYT评分来估计EMT偏离预期量的程度。使用多变量Cox比例风险模型对癌症类型进行校正的泛癌症分析显示了显著的拮抗作用，表明较高的ECI将减少免疫逃逸和生存之间的有益联系。对于黑色素瘤，较高的CYT评分只与ECI低的肿瘤的生存获益明显相关（图2B）。此外，在评估的大多数癌症类型中，与单独的EMT或CYT相比，ECI是预测较差生存结果的更准确的预后因素（图2C）。这些结果表明，免疫细胞的高度浸润并不一定表明有整体的杀伤力。
03 - EMT和免疫逃逸之间的免疫调节串联与免疫检查点阻断的反应有关
接下来，作者研究了EMT-免疫轴是否影响了临床免疫治疗反应。在五个已发表的免疫治疗数据集中，对ICB耐药的肿瘤与ECI的增加有关，这些数据集都是用ICB疗法治疗的（图3A）。总的来说，在所有的免疫治疗数据集中，ECI低的肿瘤的反应率为60.3%，而ECI高的肿瘤的反应率只有36.1%。作者进一步确定ECI在预测ICB反应方面的表现。在不同的免疫治疗数据集中，与TMB、EMT特征或CYT相比，ECI对ICB反应的预测性能始终较好，曲线下面积为0.615-0.758（图3B）。TMB在不同的数据集中表现出适度的预测性能，而CYT和EMT在其他研究的数据集中不具备良好的预测性能。对此可能的解释是，ECI被作为EMT和CYT之间串联的衡量标准来评估免疫抵抗力，因此总体上具有更好的性能。作者进一步比较了EMT、CYT和ECI在ICB反应高的癌症中的分布，包括CESC、BLCA、HNSC、LUSC和LUAD，反应相对低的包括OV、PRAD和BRCA。对于CESC、BLCA、HNSC、LUSC和LUAD，CYT相对高于其EMT，而对于OV、PRAD和BRCA，CYT相对低于其EMT。使用ECI，发现CESC、BLCA、HNSC、LUSC和LUAD的ECI值比OV、PRAD和BRCA低。这些结果强调了ECI对于识别将从免疫治疗中受益的患者的潜在临床意义。
04 - 免疫浸润的细胞组成有助于EMT和免疫逃逸之间的串扰
上图显示，几乎所有免疫细胞都产生一组相似的生长因子，并与EMT特征呈正相关。然而，免疫逃逸是由免疫效应细胞和抑制细胞的相对组成决定的。作者假设，确定免疫浸润的细胞组成对于理解免疫逃逸和EMT之间的串扰至关重要。为了验证这一假设，使用皮尔逊相关分析法对每种癌症类型的ECI与不同免疫细胞类型的相对部分之间的关联进行研究。发现CD8+T细胞、激活记忆CD4+T细胞、调节性T细胞（Tregs）、浆细胞、T辅助细胞、M1巨噬细胞和激活NK细胞的浸润与ECI呈明显的负相关。而M0/M2巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、记忆B细胞、幼稚CD4+T细胞和静息记忆CD4+T细胞在泛癌症水平上与ECI呈显著正相关（图4A）。这些结果与抗免疫逃逸的对立作用相一致。作为一个案例研究，进行免疫组化检测，标记巨噬细胞或CD8+T细胞，检测肺癌中波形蛋白的表达。M1同时表达CD68和CD16，M2同时表达CD68和CD163，代表性的图像显示在图4B中。通过评估免疫组化结果，分析了波形蛋白表达与M1、M2或CD8+T细胞浸润之间的相关性。结果显示，波形蛋白的表达与肺癌中的M1和M2数量呈正相关，但与M1/M2的比例呈负相关。同时，波形蛋白的表达与肺癌中CD8+T细胞的数量呈正相关（图4C）。
然而，免疫浸润和ECI之间的相关性也显示了不同类型癌症之间的异质性（图4D）。在大多数癌症类型中，较高比例的浸润免疫细胞与ECI呈正相关，而只有两种类型的癌症（CESC和UCEC）有较高比例的浸润免疫细胞与ECI呈负相关。
作者还研究了OV和HNSC，其中的间质亚型已被确定，并观察到在癌症的间质亚型中始终拥有相对较高的M2巨噬细胞比例，而CD8+T细胞和T辅助细胞的比例相对较低（图4D）。为了获得免疫组成如何决定ECI的总体视图，作者根据22种免疫亚群的相对比例，用UMAP对泛癌肿瘤样本进行聚类（图4E）。对免疫浸润的细胞组成的聚类分析显示了从ECI低的肿瘤到ECI高的肿瘤的明显过渡，这表明ECI是由免疫浸润的细胞组成决定的。这与观察到的对ICB的反应与ECI有关是一致的。进一步将免疫细胞分为有利于免疫的组和有利于EMT的组，它们可能分别向抗免疫逃逸或EMT倾斜。对免疫浸润的细胞组成进行表征，发现不同类型的癌症之间有利于免疫和有利于EMT的细胞分布具有异质性（图4F）。本研究中评估的大多数类型的癌症在TME中都显示出有大量的有利于EMT的细胞浸润，而只有两种类型的癌症（CESC和UCEC）有大量有利于免疫的细胞浸润。
05 - 影响EMT和免疫规避之间的免疫调节串联的分子和遗传特征的描述
接下来，作者研究了肿瘤细胞的分子和遗传特征是否会影响EMT和抗免疫逃逸之间的免疫调节串扰。据报道，基因的非同义突变有助于肿瘤细胞中新抗原的产生，因此可能增加效应免疫细胞的浸润。作者首先研究了CYT-EMT串扰与基因组特征之间的关系，发现在不同类型的癌症中，非同义突变的总体速率与CYT水平呈正相关（补充图4A），免疫细胞如CD8T细胞与ECT负相关（补充图4B）。相反，非同义突变的总量与EMT特征（补充图4C）和与ECT正相关的免疫细胞部分如M2巨噬细胞（补充图4D）都呈负相关。与上述结果一致，作者发现在多种类型的癌症中，ECI与整体非同义突变负担呈负相关（图5A），突变负荷与免疫细胞的浸润有关，与 ECT 呈负相关。
有报道称，基因组不稳定性与癌症免疫有关。作者研究了基因组不稳定性与EMT和免疫逃逸之间的相互作用的关联。在多种类型的癌症中，染色体不稳定性与ECI之间存在明显的正相关，这表明染色体不稳定性与免疫细胞的浸润正相关ECI（图5B）。由于抗免疫逃逸可能选择具有遗传特征的肿瘤，使其对免疫攻击具有抵抗力，从而富集了与免疫细胞正相关的ECI，作者进一步调查了参与抗原呈递的基因的突变。在几种类型的癌症中，HLA-A/B/C基因的突变与较高的CYT水平有关，但并不总是与明显较高的EMT特征有关（图5C）。HLA基因的突变与CD8+效应T细胞的浸润呈正相关，但与Tregs没有关联（补充图4E）。这些结果表明，HLA基因的突变并不增加EMT，尽管它们可能有利于逃避免疫攻击。
06 - 致癌基因改变与EMT和免疫逃逸之间的免疫调节性串扰有关
肿瘤驱动基因在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用。因此，作者推断致癌基因的改变可能是EMT和免疫逃逸之间的平衡的原因。作者重点研究了以前的泛癌症研究中发现的373个有突变的驱动基因和200个有CNV的驱动基因。进行了了泛癌症回归分析，调整了背景突变率和肿瘤类型，发现23个突变的、18个扩增的和20个删除的驱动基因与ECI明显相关。在这些改变的驱动基因中，CASP8是与CESC和HNSC的ECI相关的最丰富的基因（图5D）。
发现TP53信号通路的基因（如MDM2、TP53和CDKN2A）含有与ECI明显相关的驱动改变。作者观察到P53的突变与ECI呈正相关（图5D）。总之，这些确定的与ECI相关的致癌基因改变可能作为EMT和免疫逃避之间的免疫调节串扰的基因组驱动因素。
四、结论
总之，本研究采用了大规模的定量多组学方法来描述广泛的实体瘤中EMT和免疫逃逸之间复杂而动态的免疫调节串扰。确定了与EMT和免疫逃逸之间的平衡有关的潜在因素。这里介绍的所有这些结果和模型加深了对肿瘤和免疫与EMT相互作用的复杂性的理解，并可能有助于为预测免疫疗法反应的新型生物标志物的开发提供更好的机制洞察力。
