一、基因组下载及索引构建
1.1下载基因组
我下载的是支原体基因组，http://bacteria.ensembl.org/index.html
Mycoplasma hyorhinis
Mycoplasma arginini
1.2 软件安装
wget https://repo.continuum.io/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh#亲测可用
bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
conda install -c bioconda hisat2
conda install -c bioconda bowtie
conda install -c bioconda bowtie2
conda install -c bioconda bwa
1.3 建立索引文件
参考：https://www.jianshu.com/p/89b35626befa
1.3.1 Hisat2
hisat2-build -p 2 Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel.fa Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel
-p 线程
运行完成后，生成后缀名为ht2的8个文件。
使用帮助：
hisat2-build --usage
1.3.2 Bowtie
bowtie-build --threads 2 Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel.fa Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel
--threads，线程
运行完成后，生成后缀名为ebwt的6个文件。
使用帮助：
bowtie-build --usage
1.3.3 Bowtie2
bowtie2-build --threads 2 Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel.fa Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel
--threads，线程
运行完成后，生成后缀名为bt2的6个文件。
使用帮助：
bowtie2-build --usage
1.3.4 BWA
bwa index -p Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel
Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel.fa
-p，prefix of the index，指定生成index的前缀名。
运行完成之后，会生成后缀名为bwt,pac,ann,amb,sa 的5个文件。
使用帮助：
bwa index
二、比对
比对文件含有58370545对reads，或者说58370545条fragment，双末端测序。
2.1 Hisat2
ls *1.clean.fq.gz |while read id
do
hisat2 -t -q -p 2 -X 500 \
-x /media/luozhixin/本地磁盘/bioinfomatics/INDEX/hisat2/Mycoplasma_hyorhinis_sk76/Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM3136 \
-1 $id -2 ${id%_*}_2.clean.fq.gz 2>${id%_*}.hisat2.log \
|samtools sort -@ 2 -o ${id%_*}_ht2p.bam
done
-t，输出载入index和reads比对所花的时间
-q，输入为fastq文件
-p，指定线程数
-X，指定fragment的最大长度（最小长度为-I），默认500，设置以后，不支持gap比对，-X和-I数值相差越大，运行越慢
-x，指定索引文件
-1，指定双端测序中第一个文件
-2，指定双端测序中第二个文件
-S，指定输出sam文件的文件名
比对结果
Time loading forward index: 00:00:00
Time loading reference: 00:00:00
Multiseed full-index search: 00:40:12
58370545 reads; of these:
58370545 (100.00%) were paired; of these:
46328683 (79.37%) aligned concordantly 0 times
12021906 (20.60%) aligned concordantly exactly 1 time
19956 (0.03%) aligned concordantly >1 times
----
46328683 pairs aligned concordantly 0 times; of these:
4284 (0.01%) aligned discordantly 1 time
----
46324399 pairs aligned 0 times concordantly or discordantly; of these:
92648798 mates make up the pairs; of these:
92458697 (99.79%) aligned 0 times
188110 (0.20%) aligned exactly 1 time
1991 (0.00%) aligned >1 times
20.80% overall alignment rate
Time searching: 00:40:13
Overall time: 00:40:13
2.2 Bowtie
-n比对模式
ls *1.clean.fq.gz |while read id
do
bowtie -t -p 2 -q -n 3 -l 28 -X 500 -a --best --strata /media/luozhixin/0000678400004823/Indexs/bowtie/Mycoplasma_hyorhinis_sk76/Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel \
-1 $id -2 ${id%_*}_L1.2.clean.fq.gz \
2>${id%_*}.bowtie.log\
|samtools sort -@ 2 -o ${id%%.*}_btp.bam
done
-t ，打印每个阶段花费的时间
-p，线程数（或--threads）
-n，-n比对模式，种子区错配的碱基数
-l，左侧至高质量种子区的碱基数，设置越大运行越快
-X，指定fragment的最大长度（最小长度为-I），默认为250
-q，指定输入为fastq文件（-f，指定输入为fasta文件）
-a --best --strata，有多个比对结果时，只报告所有比对结果中匹配度最高的。
-1，指定双端测序中第一个文件
-2，指定双端测序中第二个文件（单端数据用--12）
-S，指定输出sam文件的文件名
比对结果
Time loading reference: 00:00:00
Time loading forward index: 00:00:00
Time loading mirror index: 00:00:00
Seeded quality full-index search: 01:35:23
# reads processed: 58370545
# reads with at least one reported alignment: 10944515 (18.75%)
# reads that failed to align: 47426030 (81.25%)
Reported 10967021 paired-end alignments
Time searching: 01:35:24
Overall time: 01:35:24
-v比对模式
ls *1.clean.fq.gz |while read id
do
bowtie -t -p 2 -q -v 3 -X 500 -a --best --strata \
/media/luozhixin/0000678400004823/Indexs/bowtie/Mycoplasma_hyorhinis_sk76/Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel \
-1 $id -2 ${id%_*}_L1.2.clean.fq.gz \
2>${id%_*}.bowtie.log \
|samtools sort -@ 2 -o ${id%%.*}_btp.bam
done
-t ，打印每个阶段花费的时间
-p，线程数（或--threads）
-v，-v比对模式，比对不超过v个碱基错配
-X，指定fragment的最大长度（最小长度为-I），默认为250
-q，指定输入为fastq文件（-f，指定输入为fasta文件）
-a --best --strata，有多个比对结果时，只报告所有比对结果中匹配度最高的。
-1，指定双端测序中第一个文件
-2，指定双端测序中第二个文件（单端数据用--12）
-S，指定输出sam文件的文件名
比对结果
2.3 Bowtie2
ls *1.clean.fq.gz |while read id
do
bowtie2 -t -p 2 -q --fast-local -X 500 -x /media/luozhixin/0000678400004823/Indexs/bowtie2/Mycoplasma_hyorhinis_sk76/Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel \
-1 $id -2 ${id%_*}_L1.2.clean.fq.gz \
2>${id%_*}.bowtie2.log\
|samtools sort -@ 2 -o ${id%%.*}_bt2p.bam
done
-t ，打印每个阶段花费的时间
-p，线程数（或--threads）
-q，指定输入为fastq文件,默认。（-f，指定输入为fasta文件）
-X，指定fragment的最大长度（最小长度为-I），默认为500
--fast-local，局部快速比对
-x 指定索引文件
-1，指定双端测序中第一个文件
-2，指定双端测序中第二个文件（单端数据用-U）
-S，指定输出sam文件的文件名
比对结果：
Time loading reference: 00:00:00
Time loading forward index: 00:00:00
Time loading mirror index: 00:00:00
Multiseed full-index search: 02:18:18
58370545 reads; of these:
58370545 (100.00%) were paired; of these:
45474574 (77.91%) aligned concordantly 0 times
12836595 (21.99%) aligned concordantly exactly 1 time
59376 (0.10%) aligned concordantly >1 times
----
45474574 pairs aligned concordantly 0 times; of these:
11476 (0.03%) aligned discordantly 1 time
----
45463098 pairs aligned 0 times concordantly or discordantly; of these:
90926196 mates make up the pairs; of these:
90861721 (99.93%) aligned 0 times
63533 (0.07%) aligned exactly 1 time
942 (0.00%) aligned >1 times
22.17% overall alignment rate
Time searching: 02:18:18
Overall time: 02:18:18
2.4 BWA
ls *1.clean.fq.gz |while read id
do
bwa mem -t 2 /media/luozhixin/0000678400004823/Indexs/BWA/Mycoplasma_hyorhinis_sk76/Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel \
$id ${id%_*}_L1.2.clean.fq.gz \
2>${id%_*}.bwa.log \
|samtools sort -@ 2 -o ${id%%.*}_bwap.bam
done
-t，number of threads
-o，指定输出sam文件名
比对结果：
#都比对上2或3
samtools fasta -@ 2 -f 3 bwa.sam|wc -l
[M::bam2fq_mainloop] discarded 0 singletons
[M::bam2fq_mainloop] processed 27708394 reads
55416788
#都没比对上12或13
samtools fasta -@ 2 -f 12 bwa.sam|wc -l
[M::bam2fq_mainloop] discarded 0 singletons
[M::bam2fq_mainloop] processed 88864414 reads
177728828
samtools fasta -@ 2 -f 4 bwa.sam|wc -l
[M::bam2fq_mainloop] discarded 0 singletons
[M::bam2fq_mainloop] processed 88938842 reads
177877684
samtools fasta -@ 2 -F 4 bwa.sam|wc -l
[M::bam2fq_mainloop] discarded 0 singletons
[M::bam2fq_mainloop] processed 27802248 reads
55604496
配对reads都比对上序列：27708394条，13854197对，23.7349%；
配对reads都没比对上序列：88864414条，44432207对，76.1209%；
都未比对上序列+单未必对上序列：88938842条，44469421对，76.1846%；
单比对上序列=单未必对上序列：27802248-27708394=93854条，0.080395%。
三、提取未比对上的序列
ls *.bam |while read id
do
samtools fasta -@ 2 -f 4 -N $id -1 ${id%_*}_1.fa -2 ${id%_*}_2.fa -s ${id%_*}_single.fa;
gzip ${id%_*}_1.fa ${id%_*}_2.fa ${id%_*}_single.fa;
done
四、重新比对未比对上序列
4.1 Hisat2
ls *1.fa.gz |while read id
do
hisat2 -t -f -p 2 -X 800 -x /media/luozhixin/0000678400004823/Indexs/Hisat2/H.sapiens/grch38/genome \
-1 $id -2 ${id%_*}_2.fa.gz \
2>${id%_*}.ht2.log\
|samtools sort -@ 2 -o ${id%%.*}_ht2p.bam
done
-t，输出载入index和reads比对所花的时间
-f，输入为fasta文件
-p，指定线程数
-X，指定fragment的最大长度（最小长度用-I指定）
-x，指定索引文件
-1，指定双端测序中第一个文件
-2，指定双端测序中第二个文件
-S，指定输出sam文件的文件名
4.2 bowtie2
ls *1.clean.fq.gz |while read id
do
bowtie2 -t -p 2 -q --fast -X 500 \
-x /media/luozhixin/0000678400004823/Indexs/bowtie2/Mycoplasma_hyorhinis_sk76/Mycoplasma_hyorhinis_sk76.ASM31363v1.dna.toplevel \
-1 $id -2 ${id%_*}_L1.2.clean.fq.gz \
2>${id%_*}.bowtie2.log\
|samtools sort -@ 2 -o ${id%%.*}_bt2p.bam
done
结果
33142842 reads; of these:
33142842 (100.00%) were unpaired; of these:
16404150 (49.50%) aligned 0 times
11456205 (34.57%) aligned exactly 1 time
5282487 (15.94%) aligned >1 times
50.50% overall alignment rate
