转录组学和甲基组学分析为水稻杂种优势的分子机制和预测提供了新的思路

Summary

  杂种优势已在多种作物上得到广泛应用。 然而，杂种优势的分子机制和预测仍不清楚。 我们获得了5个F1组合，其中4个表现出超亲优势1表现出中亲优势，并进行了转录组学和甲基组学分析，以鉴定杂种优势的候选基因，探索杂种优势的分子机制和潜在的预测因子。 转录组分析结果表明，4个优良亲本所共有的差异表达基因在分子功能方面得到了显著的富集，加性和显性效应对杂种优势的发生起着至关重要的作用。 DNA甲基化水平，特别是在CG背景下，与单株籽粒产量显著正相关。 亲本间CG背景下的差异甲基化区域与转录起始位点的比值与其杂种的杂种优势水平呈显著负相关，这一点在其他水稻品系的24对比较中得到了进一步证实，表明该比值可以作为预测杂种优势水平的一个可行指标，而生育早期亲本间该比值小于5可能是判断其F1杂种发生杂种优势的一个重要指标。 此外，我们还发现了一些重要的差异表达和甲基化基因，如OsDCL2、PI5、DTH2、DTH8、HD1和GLW7，它们在4个较好的亲本杂种中表现出差异表达和甲基化，可作为BPH的候选基因。 我们的发现有助于进一步阐明分子机制和杂种优势预测。

Introduction

  杂种优势是指杂种一代在生物量、产量、生长速度和抗逆性等方面优于亲本的现象。 自19世纪初达尔文首次发现以来，杂交育种已广泛应用于多种作物的农业生产中，如玉米、水稻、高粱、油菜和番茄等。 （Gai等人 , 2016) 自20世纪70年代以来，三系杂交水稻和两系杂交水稻首先在中国发展并得到广泛应用，然后传播到其他东南亚国家和美国，（Cheng等人, 2007)的研究，极大地促进了水稻生产。

  尽管杂种优势在作物育种和农业生产中的成功应用已有100多年的历史，但杂种优势的分子机制仍然是一个谜，尽管提出了三个主要假说：显性（Davenport，1908）、超显性（East，1908）和上位性（Powers，1944）来解释杂种优势 然而，这些遗传模型在很大程度上是概念性的，不能充分解释杂种优势的分子基础（Birchler等人 , 2010;He等人 , 2013;米勒等人 , 2015) 有趣的是，几个早期的研究使用由珍汕97B和明恢63杂交产生的相同的优良水稻杂种群体，证明了不同的杂种优势遗传模式，包括部分显性和超显性（Li et al。 ，2008），上位性（Yu et al ，1997），以及超显性和假超显性（Zhou et al ，2012），表明不同的遗传模型可能都有助于杂种优势。 最近，全基因组关联研究和其他组学方法已被用于探索杂种优势的分子基础（Huang et al。 , 2015;Yang等人 , 2017;Zhen等人 , 2017;朱等人 , 2016) 例如，Huang等人 （2015）发现，总体杂合度在杂种优势中不起重要作用，但某些特定位点的杂合度在水稻杂种优势中起重要作用。 最近的研究也提示了小RNA和表观遗传调控在杂种优势中的作用（Chen，2013；川边等人 , 2016;劳斯等人 , 2018;Li等人 , 2014;Shen等人 , 2012;张等人 , 2014;张等人 , 2015) 尽管取得了一些进展，但全面阐明杂种优势的分子机制仍然是一项艰巨的任务。

  筛选具有商业价值的F1杂交种仍然需要大量的人工劳动来进行测交试验。为了减少杂交和F1杂种评价的工作量，育种家和遗传学家一直在努力寻找预测不同亲本之间杂种优势大小的方法。 LaBorda等人 （2005）提出根据分子标记评价的遗传多样性将亲本聚类为不同的杂种优势群，以指导生产杂交种的选育。 目前，在玉米、水稻、油菜、甜瓜和拟南芥（Dafna等作物上，已有研究证明亲本间的遗传距离与其F1杂种优势水平并不完全相关。 , 2021;费尔南德斯等人 , 2015;Silva等人 , 2019;Yang等人 , 2017;尤纳斯等人 , 2012;Wang等人 , 2015) 近年来，从不同角度对杂种优势的预测进行了研究，包括胁迫应答基因表达的自然变异、（、Miller等。 ，2015），非线性表型变异（Vasseur等人， ，2019）和代谢组学途径（Dan等人 , 2021) 此外，甲基化信息与复杂的数量性状，如株高（pH，表现出预测关系。Hu等人 ，2015）与人类长寿（Horvath&Raj，2018） 然而，这些预测关系大多建立在数量遗传学和回归分析的基础上，尚未建立一种简便有效的预测杂种优势水平的方法。 在以往的研究中，一般只利用1~2个F1杂种及其亲本来研究遗传机制，不能有效地区分中亲优势和超亲优势。 实际上，在培育具有商业价值的农作物和蔬菜杂交品种方面，杂种优势比MPH更有价值。 本研究选用2个优良恢复系：广恢998（R998）和广恢308（R308），2个保持系：五丰B（WFB）和荣丰B（RFB），代表我国南方优良杂交稻亲本（其杂交组合至2020年底累计种植面积超过2200万公顷）配制5个杂交种。 其中4个杂种表现为杂种优势，而来自两个保持系的一个杂种表现为杂种优势。 因此，我们可以通过研究转录组和甲基组的变化来揭示水稻杂种优势发生的分子机制，探索潜在的预测因子。

结果

几个产量相关性状的杂种优势评价

  为了便于产量相关性状的研究，利用2个恢复系R998和R308与2个保持系WFB和RFB配制了5个F1杂种：WY998（WFB/R998）；WY308（WFB/R308）；RY998（RFB/R998）；RY308（RFB/R308）；和WR（WFB/RFB） 我们分别评估了5个F1杂种的穗数（PN）、pH、每穗粒数（GNPP）、千粒重（KGW）和单株籽粒产量（GYPP）的杂种优势水平（表S1）。 我们观察到4个杂种WY998、WY308、RY998和RY308表现出较高的pH（0 BPH为6-9%），大GNPP（1 1–24 7%用于BPH），较大的千克重（2 3–7 BPH为1%）和较大GYPP（9 6– 28 杂种优势的）为7.6%，而5个杂交组合F1与其亲本的PN仅为7.7% ~ 9.7%。 03到8.53因此不适用于评价杂种优势水平 杂种WR在上述4个性状上的表现与亲本平均值相似。 总体而言，对于pH、GNPP、KGW和GYPP，4个有商业价值的杂种WY998、WY308、RY998和RY308表现为杂种优势，而由两个保持系WFB和RFB衍生的杂种WR仅表现为MPH 因此，了解较好亲本杂种和中间亲本杂种转录组和甲基组的差异有助于鉴定杂种优势的候选基因。

基于转录组分析的杂种优势候选基因鉴定

  我们对5个杂交种及其4个亲本的幼叶（移栽后20天）、幼穗（抽穗前10天）和灌浆穗（开花后15天）进行了3次重复的全球转录组测序 从每个基因型的文库中获得了大约81.3–1.22亿个mRNA-seq读数，并且超过85%的读数被定位到参考基因组（http：//mbkbase org/r498/；表S2）。 三个重复之间的mRNA-seq数据显示高度相关性（R2>0。 869;图S1）。

  我们调查了5个杂交水稻F1代相对于其亲本的幼苗、幼穗和灌浆穗中的差异表达基因（DEGs），并检测到大量的DEGs[错误发现率（FDR）<0 05]在三种类型的测试组织中（表S3） 为了筛选与杂种优势相关的潜在DEGs，我们重点研究了仅在4个较好亲本杂交种中重叠的DEGs作为杂种优势的潜在候选基因，并在幼苗、幼穗和灌浆穗中分别鉴定出480、631和259个上调的DEGs（图1A–C）和198、316和99个下调的DEG（图1D–F；表S4）。 我们注意到，约有40%的重叠上调基因在F1代幼苗中的双亲之一中不表达，表明显性效应可能在早期生长阶段的杂种优势中起重要作用。 令人惊讶的是，基因本体论（GO）富集分析表明，大多数重叠的DEG仅被归类为分子功能（FDR<0 05）在三种类型的测试组织中（图2A–C），只有少数上调的DEG显著地聚集在与代谢过程、磷酸化和氨基酸生物合成相关的生物过程中（图2A，B） 然而，一些先前报道的稻瘟病抗性位点，包括OsDCL2（Zhang et al。 ，2015），PI33（Berruyer等人 ，2003），PID2（Chen等人 ，2006）和PI5（Lee等人 ，2009），被检测为在大分子代谢过程和碳水化合物衍生物结合方面富集 表达模式分析表明，在四个较好的亲本杂种中，OSDCL2、PI33和PI5表现出加性表达模式，而PID2与父本R998和R308的表达模式接近，表现出显性表达模式（图2D）。 这些结果表明，这些抗性位点可能是重要的杂种优势基因。

  基于等位基因特异性表达的杂种优势遗传模型和候选基因分析（ASE）

  杂种中两个亲本等位基因表达水平之间的酶被认为是杂种优势的机制（Shao et al。 , 2019) 为了了解ASE在杂种优势中的潜在作用，我们对亲本间ASE的差异表达进行了分析 根据ASE基因的表达模式，将杂种F1中的ASE基因（ASEGs）分为3类：（1）加性ASEGs：表达水平接近双亲平均值；（II）显性基因：表达水平与一个亲本显著不同而与另一个亲本相似 表达水平与父本相近的称为雄性基因，与母本相近的称为雌性基因；和（III）超显性基因：高于较好亲本或低于较差亲本的表达水平.

  利用R498（http：//mbkbase.org/r498/）的基因组序列，在四个亲本之间检测到大量的单核苷酸多态性（SNPs）。 作为变异检测的参考序列，使用软件GATK3（图S2） 相对于参考基因组序列，我们在R308中随机选择了49个SNP，并设计引物来验证这些变异（表S5）。 在设计的49对引物中，有45对能成功扩增。 对它们的PCR产物进行测序，检测到的变异与RNA-seq的信息完全一致，表明检测到的亲本之间的SNPs可用于分析F1杂种中的ASE。

  在F1杂交种中鉴定了许多ASEG（表S6）。 我们调查了每种类型的ASEGs的百分比，发现对于四个较好的亲本杂交种，大约46.8%, 43.4%和31.3% 幼苗、幼穗和灌浆期的加性基因, 约49.4%, 52.9%和62.9%为优势基因，只有3.8%, 3.8%和5.9% 在幼苗、幼穗和充实穗中是超显性效应基因（图3A–C）.而对于中亲杂种WR，大多数ASEGs（58.1%, 77.7%和78%）在幼苗、幼穗和灌浆穗中分别表现为显性效应。 还有，大约26.4%, 1.3%和14.4% 在幼苗、幼穗和充实穗中为超显性基因（图3D–F）。 ASEGs的比例（46.8%, 43.4%, 31.3%）在较好的杂交组合中远高于（15.5%, 21.0%, 7.6%），而超亲组合中显性和超显性基因的总比例（53 2%, 56 6%, 68 7%）低于中亲杂种WR（84 5%, 79 0%, 92 4%）（表S6），表明加性和显性基因在杂种优势中起着重要作用，这与以前的研究一致（Guo et al , 2006)。

  在四个较好的亲本杂种中共有的显性基因中，分别在三个测试组织中鉴定出94、38和93个显示雄性优势的重叠基因（图3G）和70、36和3个显示雌性优势的共享基因（图3H）（表S7）。 仅在4个优良亲本组合中共有的父本显性基因比母本显性基因多，尤其是在幼苗和灌浆期，表明父本（恢复系）比母本（不育系）更能发挥杂种优势。在重叠的雄性显性基因中检测到几个重要的基因，如OsMADS51、PID2、Hd3a、Ehd1和Osgme1，它们对杂种优势的形成非常重要（表S7）。 这一发现与（Huang等人之前的研究一致。 , 2015;魏等人 , 2021)

  F1杂种及其亲本的DNA甲基化

  为了探索DNA甲基化在杂种优势，特别是杂种优势中的作用，我们研究了5个杂种及其亲本的幼苗、幼穗和充实穗的甲基化谱（表S8）。 据观察，与其亲本相比，4个较好亲本杂种在幼苗中表现出增加的总DNA甲基化和CG和CHG甲基化，而中亲F1杂种WR的甲基化水平与其两个亲本在幼苗中的平均值（MV）相似（图4A，B），这表明杂种中的甲基化水平可能与其杂种优势水平相关 此外，我们还观察到，与其亲本相比，所有杂种的甲基化水平在圆锥花序中都有所增加（图S3）。 因此，我们研究了9个基因型（5个杂种和4个亲本）的甲基化水平与其GYPP之间的相关性。 在所有的胞嘧啶环境中都观察到了正相关性，特别是在幼苗的CG环境中，相关系数（R2）分别为0.645（mC），0,919（mCpG），0.739（mCHG）和0.181 （mCHH）（图4C-f） 然而，穗中的甲基化水平与GYPP之间的相关性似乎不显著或较弱（图S4），这表明生长早期的甲基化状态可能在杂种优势的形成中发挥更重要的作用。

  我们进一步研究了在所有胞嘧啶背景下不同基因组功能区的甲基化状态。 我们发现在杂交体及其亲本的不同基因组功能区中表现出不同的甲基化模式（图4G）。 在genebody区域，特别是外显子区域，CG甲基化水平在这些品系中差异显著，而CHG和CHH甲基化水平差异不显著。在包含转座元件（TEs）的重复区中，非CG甲基化水平在这些品系之间表现出显著差异，而在TEs中CG甲基化水平几乎相同。在启动子和内含子区域中，这些细胞系在三种胞嘧啶背景中具有相似的总体甲基化水平模式 因此，基因体特别是外显子的CG甲基化模式和TES中的非CG甲基化模式可能在杂种优势中起着至关重要的作用。

  转录组和甲基化组谱之间的关联分析

  由于CG和CHG甲基化水平与GYPP显著相关，我们进一步分析了差异表达与CG和CHG甲基化之间的相关性。结果表明，差异表达与CHG甲基化呈显著负相关，其相关系数大于CG甲基化，但5个杂交种之间CHG甲基化的相关系数几乎相同（表1），这表明CHG甲基化对F1杂交种基因差异表达的影响可能大于CG甲基化，但可能与BPH无关。CG甲基化，尤其是CG低甲基化与基因的差异表达显著相关，但相关性不显著或很弱（0.13和0.1中亲杂交WR的）。 此外，在四个较好的亲本杂交体中，超甲基化的相关系数比低甲基化的相关系数小得多，这至少可以部分解释为什么在较好的亲本杂交体中上调的基因比下调的基因多（表S3）。

  此后，我们调查了DEGs和差异甲基化基因之间的共享基因（DMGs）在相应的配对组合中作为杂种优势的候选基因，并观察到大约1/3的DEGs与4个较好亲本杂种和它们的亲本之间的差异甲基化直接相关（表S9），这与以前的研究一致（Eichten et al , 2013;Li等人 , 2015;Schmitz等人 , 2013)。因此，我们重点研究了4个超亲杂种幼苗中DMGs和DEGs之间共享的基因，并鉴定了一些与产量或抽穗期相关的基因，如DTH2（Wu et al。 ，2013），HWH1（Jiang等人 ，2008），GLW7/OsSPL13（Si等人 , 2016;魏等人 ，2021），HD5（Fujino等人 ，2013）和HD1（Zhang等人 , 2012;图5），可能是杂种优势形成的关键候选基因。值得注意的是，DHT2在4个较好的亲本杂种与其母本WFB或RFB之间的所有配对组合中均被检测到。值得注意的是，在5个杂交种及其亲本中，其基因体和启动子的甲基化程度不同，并且在WFB和RFB的启动子区检测到基因组DNA序列的缺失（图6和S5；表S10），这表明甲基化的差异可能是由DNA序列的结构变异引起的

  差异甲基化区（DMR）和杂种优势预测因子的分析

  我们称这些DMR为差异甲基化区，并使用全基因组滑动窗口方法（窗口大小为200bp，步长为50bp）对4个亲本之间以及亲本与其5个F1杂种之间鉴定的DMR中的相关基因（非_TE基因）和TES进行了注释。 在不同的配对比较中鉴定出大量的DMR，亲本之间的DMR远多于F1杂种与其亲本之间的DMR（表S11），表明并非所有的甲基化差异都与杂种优势有关。然后，我们重点研究了不同胞嘧啶背景下亲本间DMR的特征，以探索预测其F1杂种优势水平的潜在线索。在幼苗和幼穗中，4个较好亲本组合的CG DMR（R 998_对_WFB、R 308_对_WFB、R 998_对_RFB和R 308_对_RFB）均多于相应亲本之间的CHH DMR，而在中亲F1组合WR中，其亲本之间的CG DMR在所有3个测试组织中均少于CHH DMR。 因此，在作物育种中，通过研究生长早期亲本间不同胞嘧啶背景下的DMR特性，可以有目的地筛选亲本，培育具有杂种优势的新型杂交种。

  由于5个F1杂种及其4个亲本的CG基因体甲基化（GBM）的总体水平与产量相关性状的表现高度一致，我们进一步调查了成对比较中DMRs的分布，特别是在不同功能区（包括外显子、内含子和转录起始位点（TSSs）的亲本之间。表S12）。 我们观察到，4个优良杂种与其相应亲本之间的外显子、内含子和TSSs的CG DMR比中亲杂种WR与其亲本之间的CG DMR更多，尤其是在幼苗中。 有趣的是，我们注意到，在所有三个测试组织中，四个较好亲本杂种的亲本之间的外显子中的DMR显著少于中等亲本杂种WR的亲本之间的外显子中的DMR，而四个较好亲本杂种的双亲之间的TSSs中的DMR远多于中等亲本杂种WR的双亲之间的TSSs。 5个杂交种的亲本之间在内含子中的DMR数量没有显著差异。 因此，外显子和TSSs中CG DMRs在不同水稻亲本间的分布特征似乎与其杂种优势水平相关。 进一步的相关分析表明，外显子中CG DMR的数量与双亲间呈显著负（R2=0.99。 960）与其杂种的杂种优势水平呈正相关，而双亲间TSSs的CG DMR数呈正相关（R2=0。623）与其杂种的杂种优势水平相关（图7A，B）。

  由于外显子中的CG DMR和亲本之间的TSSs与其F1杂种的杂种优势水平表现出不同的相关性，我们计算了每个成对组合中外显子中的CG DMR数量与TSSs中的数量的比率，以评估相关性（表S12）。 我们发现，在4个较好的亲本杂种中，外显子中CG DMR的数目与TSSs中CG DMR的数目的比值小于5（范围为3.18比4.73),亲本WFB与中亲杂种WR的RFB之间的差异大于8（范围为8.12至16.34）。 特别是在幼苗中，该比率（16.34) WFB和RFB之间的差异远大于（4.03到4.73 小于5)。 4个）优良杂交组合的亲本间。 相关分析表明，亲本间CG DMR数目与TSSs中CGDMR数目的比值与其杂种优势的大小呈极显著负相关，在幼苗、幼穗和充实穗中分别为相关系数高达0.982, 0.962和0.991 （图7C–E），这意味着亲本之间外显子中的CG DMR数量与TSSs中的CG DMR数量的比率可以作为其F1杂种优势水平的可行预测指标

  为了验证上述推测，我们选择了19个水稻品系，包括17个在中国商业生产中广泛使用的杂交水稻亲本品系（表S13），并对移栽后20天（DATS）的幼苗进行了甲基组学测序,在粳稻_与_粳稻、粳稻_与_籼稻、籼稻_与_籼稻等25个配对组合中，外显子的CG DMR数目与双亲TSSs的CG DMR数目之比分别小于3、小于5、大于5和高达19.34,在粳稻_与_籼稻、籼稻保持系_与_恢复系（及其相应的F1杂种已广泛用于水稻生产），籼稻保持系_与_保持系和粳稻_与_粳稻，分别为（图7F；表S14）。 不同类型水稻品系间的比值趋势与籼粳杂种F1>籼籼杂种F1>粳粳杂种F1的杂种优势大小正好相反（Shen et al。 , 2015). 因此，可以看出，外显子中CG DMR数目与TSSs中CG DMR数目的比值与杂种优势水平之间的负相关性得到了进一步证实。据此推测，该比值可作为杂交水稻育种中预测杂种优势水平的直观指标，小于5的比值可作为判断生长发育早期杂种优势F1杂种的临界指标。

  讨论

  杂种优势的候选基因

  在本研究中，通过对4个较好亲本杂交种和1个中亲杂交种的转录组分析，筛选出仅在4个较好亲本杂交种中共享的DEG作为杂种优势的候选基因。 鉴定了数百个共享基因，但它们中的大多数被富集到分子功能的术语中，只有一小部分上调的DEG被富集到代谢和磷酸化过程中，这些结果进一步证实了大多数对杂种优势有贡献的基因座对重要农艺性状影响较小的推断（Schnable&Springer，2013）。

  甲基化水平，特别是在CG和CHG背景下，与GYPP显著正相关。转录组和甲基化组谱之间的关联分析显示显著相关。在4个较好亲本的杂种中，约有1/3的差异表达基因也表现出差异甲基化，表明这些基因的差异表达可能是由甲基化直接引起的。因此，我们将重点放在四个较好的亲本杂种中的DEGs和DMGs之间的重叠基因作为BPH的关键候选基因。在这些共享基因中，一些重要的控制抗病性、抽穗期和产量相关性状的基因，如OsDCL2、Pi33、Pi5、DTH2、HD1、EHD1、DTH8、OsGME1和GLW7，被鉴定（黑色）中标记的图5，这些基因以前被报道影响产量相关性状或与杂种优势有关（Huang et al , 2015;Si等人,2016; Urayama 等人,2010; 魏等人,2010; 魏等人,2021) 抗病基因的感病位点可能具有重要的生物学功能，其突变通常会对植物生长、发育和作物产量产生不良的多效性效应（Li et al., 2022) 通过表观遗传机制和昼夜节律（Miller等人在胁迫条件下诱导胁迫应答基因的表达以抵抗病原体入侵，并在非胁迫条件下促进生物量杂种优势。 , 2015;Yang等人 , 2021) 此外，在中亲杂种中也检测到了DTH2，并且在四个亲本中也证实了其序列变异。据报道，DTH2与早抽穗和在长日照条件下增加繁殖适合度相关（Wu等人 , 2013) 因此，DTH2基因可能是华南双季稻区的一个优势基因。

  基因组DNA甲基化与杂种优势的分子机理

  尽管几十年来杂种优势在作物育种和农业生产中得到了成功的应用，但其分子机理仍不清楚。 越来越多的证据表明，基因组DNA甲基化对杂种优势有很大的影响，（Groszmann等人 , 2013;He等人 , 2013;劳斯等人 , 2018;Shen等人 , 2012)。 我们的工作表明，5个杂种及其4个亲本的总体甲基化水平，尤其是在CG和CHG背景下，与其GYPP显著正相关。

  与亲本相比，杂种F1在基因体上表现出不同的CG甲基化，在TEs上表现出不同的非CG甲基化，表明DNA甲基化水平，尤其是基因体CG甲基化和TE非CG甲基化水平可能是杂种优势的关键。已经表明，在不同的胞嘧啶背景下，基因和TES上的DNA甲基化在植物中具有不同的调节作用（Zhang等人 , 2018) GBM在植物物种中高度保守，并且主要富集在组成型表达的管家基因中，（等 , 2015;Bewick&Schmitz，2017），表明身体甲基化基因在功能上很重要。甲基组与转录组的关联分析表明，CG GBM，尤其是CG HYPO-GBM和CHG GBM与杂种F1基因的差异表达呈显著负相关。 CHG GBM的甲基化系数大于CG GBM的甲基化系数，表明CHG甲基化在杂种优势中起着重要作用（Ma et al , 2021) 然而，在我们的研究中，5个F1组合中CG GBM的相关系数与5个F1组合的杂种优势水平一致，而CHG GBM的相关系数几乎相同。 这些结果表明，CHG GBM在杂种中的差异表达可能比CG GBM更重要，但CG GBM在杂种优势尤其是杂种优势的形成中比CHG GBM更重要。

  DNA甲基化标记与杂种优势预测

  众所周知，迄今为止，筛选具有强杂种优势的F1杂种仍然是一项艰巨的任务。 遗传学家和育种学家一直试图在不同水平上寻找预测杂种优势的相关线索，包括遗传距离（基因组水平。LaBorda等人 ，2005），基因表达（转录组水平；米勒等人 ，2015），非线性表型变异（表型组水平；Vasseur等人 ，2019）和代谢组学途径（代谢组学水平；Dan等人 , 2021) 越来越多的研究（Fernandes等人）表明，在多个物种中，遗传距离与杂种优势的强弱并不完全相关。 , 2015;Silva等人 , 2019;Wang等人 , 2015;Yang等人 , 2017)。其他几项组学研究不能简单直观地预测杂种优势水平。 甲基化信息已被用于预测复杂的数量性状，如pH和人类寿命（Horvath&Raj，2018；Hu等人 , 2015)。 在我们的研究中，我们观察到甲基化水平与GYPP之间的显著相关性，以及CG DMR在较好亲本和中等亲本F1的亲本之间基因体不同功能区域的不同分布特征。 据报道，GBM优先出现在外显子和内含子上，很少出现在TSSs和转录终止位点（Takuno&Gaut，2013）。 相关分析还表明，外显子的CG DMR和TSSs也分别与其F1杂种优势的大小呈负相关和正相关。 用外显子中CG DMR或TSSs的绝对数目来评价任何两个亲本之间的杂种优势水平并不容易和准确。 它们的比值与相应杂种F1的杂种优势水平显著相关，相关系数也大于外显子和TSSs中CG DMR的绝对数。 这种相关性也在来自另外19个不同类型的水稻品系的24个成对组合中得到证实。因此，我们认为外显子中CG DMR与TSSs的比值是亲本间杂种优势的潜在预测因子，而小于5的比值可能是基于本研究中所用的23个亲本来判断杂种是否具有杂种优势的关键指标。