1. Author
José Ordovas-Montanes在哈佛免疫学专业攻读研究生。毕业后进入麻省理工学院Alex K.Shalek实验室研究人类干细胞如何被炎症塑造和记忆。2019年在波士顿儿童医院成立了他的团队，继续研究炎症与上皮细胞和免疫细胞之间的关系。
2. Background
众所周知，根据解剖部位的不同，呼吸道可以分为上下呼吸道和远端呼吸道。鼻粘膜作为下呼吸道的主要通道，负责平衡嗅觉、过滤与宿主防御等功能。为了实现这些功能，鼻子不同的解剖结构中具有不同的分泌专门蛋白质的细胞亚群。然而，有研究表明许多呼吸道病原体可以绕过鼻子直接传播到肺部，导致严重疾病。
此外，鼻组织的炎症状态影响病毒感染轨迹。诸多针对冠状病毒的研究表明干扰素（IFN）在鼻腔中起保护作用。在SARS-CoV-2感染期间，有实验团队对人鼻咽部的单细胞分析表明：相对于轻度病例，重度疾病的上皮细胞中IFN反应减弱。
除了新冠外，研究团队发现:IAV、水疱性口炎病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和感染后，可在鼻粘膜中产生分泌IgA的浆细胞。 而在鼻喷疫苗的人群中，实验团队发现：在上呼吸道甲型流感病毒（IAV）感染后形成的CD 8+组织驻留记忆（TRM）细胞与针对异源IAV毒株再攻击的增强的保护相关。
综上所述，感染后组织层面的免疫记忆的建立至关重要，同时，了解他的机制可以帮助我们开发有效持久的疫苗。建立的普遍机制可以概括为如下步骤：开发有效持久的疫苗，我们必须更好地了解自然感染后组织规模记忆的建立机制。顺序为：免疫细胞和/或上皮细胞对病原体相关分子模式的识别导致细胞因子的产生，其广泛激活骨髓细胞，反过来，募集病原体特异性效应淋巴细胞，其中一些将发育成循环和TRM细胞。在病毒再攻击期间，TRM细胞表现出抗病毒功能，并可激活感染部位的多细胞反应。然而，迄今为止，大多数研究都集中在记忆反应期间细胞类型的个体作用或有限的相互作用上。这篇文献就试图从整体的组织层面描绘流感感染后的免疫记忆反应。
3. Result
实验团队在感染后0、2、5、8和14天切取鼻粘膜组织进行scRNA-seq。为了更好的对区域进行划分与后续实验，将组织分为三个区域：呼吸道粘膜（RM），包括鼻甲NT和上颌鼻甲、鼻中隔;嗅粘膜（OM）位于上颌窦中的侧鼻腺（LNG）。通过免疫荧光不难看出上皮(蓝)/神经（绿）/免疫（红）组织存在异质性。
实验团队收集了15万个单细胞转录组。神经元和上皮细胞占数据集的一半以上。主要细胞类型在不同区域分布不均匀：OM中富集神经元、粒细胞、B细胞和造血干细胞（HSC），RM中富集更多上皮细胞、成纤维细胞、髓样细胞、T细胞和NK细胞。我们知道筛鼻甲骨含有大量的骨和骨髓，这可能就是OM富集HSC的原因。为了描述鼻粘膜中细胞亚群和状态的多样性，根据细胞类型进行新的聚类分析，共产生127个聚类。我们看到了强烈的区域分离。
之前有研究报道过肺中免疫细胞与上皮细胞再感染后的变化，但是鲜有鼻黏膜相关研究。总鼻粘膜病毒滴度显示感染2 dpi时最高，随后逐渐减弱，14 dpi时被清除。就感染位置而言，实验团队看到主要局限于RM中的上皮细胞。随后对总RM进行了qPCR以验证对感染的早期应答，发现IFN应答信号直到5 dpi才富集，尽管Ifnb 1在2 dpi水平升高而，鉴于采样限制，我们不能排除IFN应答发生在2和5 dpi之间。
既然明确了感染后，RM存在影响，实验团队就具体描绘感染如何重塑每个鼻部区域。将每个时间点的样本进行PCA分析。OM，5,14dpi分离。LNG，仅14-dpi样品与其余样品分离。相比之下，RM PC 1 -2中按时间顺序排列的所有时间点之间存在明显分离。这提示我们RM感染过程中发生了动态和关联的反应。从图中可以看出：naive和2dpi中的静息基底细胞、成纤维细胞和纤毛细胞转变为到5和8dpi的多样化活化的骨髓和淋巴簇。以便在病毒消退14 dpi后转变为特异性杯状/分泌细胞、TRM样细胞和成熟骨髓细胞。
（从上述结果与荧光染色发现，病毒感染集中在RM的上皮细胞上，所以接下来实验团队又聚焦再上皮细胞上）对其分析产生了28个聚类，涵盖了不同的分化状态和功能。同时鉴定了在鼻黏膜中特异的细胞簇。当然，上皮细胞簇在不同区域分布不均匀OM：鼻丛细胞、离子细胞、Dclk 1+细胞和嗅觉神经元支持细胞，LNG：浆液细胞和腺细胞。为了了解IAV感染如何影响鼻上皮细胞，我们确定了哪些簇含有病毒读数。发现IAV+细胞富集在IFN刺激的簇中，随后是基底细胞和纤毛细胞。尽管感染在2dpi时已充分建立，但IFN刺激的上皮细胞仅在5dpi时出现，并在5和8dpi时占所有RM上皮细胞的20%。（为了理解不同IFN对IFN刺激的上皮亚群的作用，体外用IFNa或IFNg刺激的基底细胞基因列表对这些细胞进行评分）。IFNa：细胞5dpi得分较高，而对于IFNg，细胞8dpi得分较高。
循环基底细胞显示出类似瞬时增加，在 5dpi到达峰值。无独有偶，许多ISG在该时间点显著增加。鉴于上皮细胞的IFN应答可以阻碍下气道的增殖和组织修复，实验团队评估了鼻基底细胞是否共表达细胞周期和IFN应答相关蛋白：IFNa应答评分随时间变化，但G2 M检查点评分在各时间点之间均匀分布，且独立于IFNa应答。因此，不像它们的下呼吸道对应物，增殖的鼻基底细胞可以在原发性感染期间与非增殖的IFN刺激的基底细胞一起的同时ISG表达。此外，两种罕见的亚群-Meg 3 + MHC-II+和Krt 13 + Illa +-在14 dpi积累。Meg 3 + MHC-II+亚组高度表达母源印记的Meg基因，还独特地表达Fezf 2，这是一种与胸腺自身抗原表达和胸腺上皮细胞免疫耐受诱导相关的转录因子。Krt 13 + Il 1a+亚群: Krt 13,存在于人类鼻甲与基底细胞上的角蛋白。该亚群出现了几种气管丘细胞特异性标志物，包括Lgals 3，Ecm 1和Anxa 1。与丘细胞不同，该亚群表达几种分泌型和膜结合型免疫细胞调节因子的基因，包括Il 1a、Tnf、Cd 274（PD-L1）、Ifngr 2和Cxcl 16，以及分泌型蛋白如Defb 1、Muc 4和Muc 1。（鉴于Krt 13+细胞与免疫细胞沟通的潜力）对Krt 13进行染色。Krt 13的最强信号是位于RM前部，即鼻粘膜与口腔粘膜相遇的地方。同时还观察到感染后样品中Krt 13染色和与PD-L1的共定位增加。因此，在IAV感染消退后，具有免疫通讯潜力的鼻上皮细胞的罕见亚群在RM中积累。
之前有文献报道RSV感染前鼻内中性粒细胞活化与症状发生存在着正相关，实验团队将捕获的粒细胞（n = 7987）进行转录和频率变化分析发现：中性粒细胞发育是连续的。许多中性粒细胞来源于OM样本可能大量存在于骨髓中。紧接着对OM和RM进行拟时间分析，其数据库分析的数据库为血液和全身中已知的成熟基因表达patterns。作者团队推测：前体和未成熟的中性粒细胞主要存在于OM样本的骨髓中，随后在RM中活化和成熟。感染后2天，RM中的中性粒细胞成分转变为成熟的IFN刺激和MHC-Ihi状态，同时在假时间发育轨迹的末端附近出现抗微生物的不成熟亚群。中性粒细胞的积聚是感染后RM最早的变化之一，并造成了I型IFN反应。因此，中性粒细胞活化和成熟可作为早期IAV感染的标志。
当描绘完中性粒细胞，上皮细胞后，实验团队探索了一些髓样，非粒细胞之间的异质性——巨噬细胞，树突状细胞等。大多数髓样簇存在于所有鼻区域中，除了一些例外，如IFN刺激的单核细胞和MDM，其限于RM，5和8 dpi达到峰值。表明在该间隔期间募集的单核细胞在RM内分化成MDM。Mono和MDM的增长与几种较低巨噬细胞群的频率一致，可能反映了随着单核细胞从外周循环到浸润，组织中骨髓细胞总数的总体增加。(为了理解IFN刺激的单核细胞和MDM之间的差异),进行差异表达分析：尽管单核细胞比MDM具有更高的ISG表达，但与静息组织巨噬细胞相比，MDM仍以高水平表达ISG。IFN刺激的MDM表达更多的Cxcl9和Cxcl16，其受体（分别为CXCR3和CXCR6）支持肺中的TRM细胞发育。比较IFN刺激的单核细胞和MDM体外对巨噬细胞培养物的IFN α和IFNg刺激的反应评分，与IFN刺激的上皮细胞相似，在5dpi显示相对较高的IFNa评分表达，在8dpi显示相对较高的IFNg评分表达。IFN刺激的MDM簇具有所有骨髓细胞中最大数量的IAV+细胞（图S4 I）。抗原呈递和免疫细胞募集能力降低，IAV抑制骨髓细胞活化和成熟。之前提到：表明在该间隔期间募集的单核细胞在RM内分化成MDM。为了测试这一点，用CCR2消除循环单核细胞。在鼻粘膜中，对patrolling（Ly6C+）分化的单核细胞进行染色（单核细胞在分化成MDM时增加MHC-II、F4/80和CD64表达）。消耗导致在8dpi巡逻单核细胞的频率降低0。此外，MHC-II+细胞的比例和数量（即分化的MDM）显著较低，表明在8dpi通过scRNA-seq测量的IFN刺激的MDM的大部分来源于单核细胞。总之，这些数据表明，IAV感染诱导抗病毒单核细胞的大量募集5 dpi，其在RM中分化为8 dpi的MDM。
之前的数据发现Mono和MDM在感染后5，8天积累，推测在这期间可能会存在强烈的淋巴细胞反应。所以实验团队聚焦在了NK和T细胞，因为他们对病毒的清除至关重要。实验团队对其进行分析：大多数T和NK细胞簇富集或局限于RM，但在OM和LNG中也发现了Ccr 7 + CD 8 + T细胞、ILC和gdT细胞。IFN刺激的T和NK细胞在5 dpi时累积，同时细胞毒性NK细胞在8 dpi时保持升高。在8dpi时，IFN应答转变为效应抗病毒T细胞亚群，具有高丰度的Gz + CD 8+、Th 1-样Ifng+ Cd 200 + CD 4+、循环和Helios+ T细胞簇。然而这种应答持续的时间非常短，随后又被TRM样和静息CD 4 + T细胞取代。在匹配的时间点对RM组织进行流式细胞术证实了在5和8dpi时CD 69 + CD 103 -活化的CD 8 + T细胞的流入，并随着CD 69 + CD 103 + TRM样细胞的积累在14 dpi减少。尽管可检测到的感染主要限于RM，但TRM细胞在OM和LNG 14 dpi中也增加，表明即使是低水平的感染也会导致TRM积累。对比了已经发表的TRM特征，发现本文发现的Cd 103 + CD 8 + T细胞与其他组织中真正的TRM细胞类似。对于泛组织标记，评分最高。同时发现这类细胞具有较高的Runx 3表达和低水平的Tcf 7和Klf 2。总之，在病毒清除后，RM 8dpi中的效应T细胞应答被跨所有鼻粘膜区域的TRM样细胞取代。
IAV感染后，局部粘膜浆细胞和活化的B细胞分泌中和IgA进入气道。在肺中，初次感染后形成记忆B细胞可在再感染后recall以产生额外的抗体，同时还有研究表明感染可导致周围和远端B细胞亚群的长期变化。我们鉴定了naive和发育中的B细胞群（主要在OM中）和罕见的IgG+/ IgA+早期浆母细胞群。Pro-B细胞和Pre-B细胞共同构成OM 5 dpi中所有B细胞的80%-90%，表明IAV感染可能诱导B-cell增殖分化，并向其他区域输送成熟的B-cell。流式染色结果证明14 dpi时RM和LNG中IgA+细胞的增加。染色也证实了感染后两个区域中IgA+细胞的存在。因此，B细胞可能在急性IAV感染期间经历增殖发育，并且IgA细胞在清除后在RM和LNG中积累。
之前我们能看出细胞亚群与亚群之间存在着此消彼长或者相辅相成的现象，那么实验团队想要知道多个细胞亚群之间的成分变化是如何协调的。在RM中找到具有类似丰度轨迹的细胞团101个显著比例的集群对。同时构建一个由所有比例集群对组成的网络，研究了具有高比例的群组。发现IFN刺激的亚群和效应T细胞亚群呈现高度的比例性。考虑到8dpi的时候有大量的骨髓以及T细胞应答，同时活化的MDM可能与DC细胞一起作为抗原提呈。所以把目光聚焦在C图所示的细胞上，他们在dpi5的时候开始积累，8dpi到达峰值，dpi14消弱。接下来实验团队利用NICHES评估了细胞与细胞之间的相互作用。发现MDM与两种效应T之间集中配体受体的表达量增加显著：Cd 274-Pdcd 1（PD-L1-PD-1）、Cd 86 Cd 28、Cxcl 9/10-Cxcr 3和Cxcl 16-Cxcr 6。成像证实RM CD 8 + T细胞和MDM/DC 8dpi的空间接近性。（第二大网络包括各种髓系、粒细胞和上皮细胞。所有三个群在病毒清除14 dpi后达到峰值。相互作用表明，在RM病毒清除后，Gp 2 + Lyz 2+杯状/分泌细胞可以招募和调节Cd 103 + DC和成熟的中性粒细胞）
Dpi8 表达Cxcl16的MDM与表达CXCR6的效应T细胞一同增殖，Dpi14表达 Cxcl 16的Krt 13 + Illa+上皮细胞，Cxcr 6 + TRM样和CD 4 + T一同增殖。对这三个集群中14 dpi的细胞进行了细胞互作分析。已经有研究报道了CXCL 16-CXCR 6信号传导在下气道TRM定位中的作用，除了注释Cxcl 16-Cxcr 6相互作用外，该分析还捕获了其他相互作用，如图C。在Naïve和14dpi，RNAscope证实：①表达Cxcr 6的细胞附近存在表达Cd 274（PD-L1）和Cxcl 16的Krt 13+细胞。②在14 dpi时，在Krt 13+区域内Cxcl 16转录物的相对丰度更高。作者将这一类细胞定义为KNIIFE。这类细胞是鼻底细胞的一部分，在14 dpi时与髓样细胞一起表达Cxcl 16，对协助TRM细胞病毒清除有至关重要的作用。
在研究过随着流感感染时间的推进鼻黏膜各个组织的反应之后，实验团队试图探究感染毒株对免疫反应的影响。在初次感染PR8 60天后再次感染PR 8或IAV X31（H3 N2毒株）。区别在于两次PR8组，再次感染时抗体会起到保护作用，PR8与X31组则再感染时抗体保护失效，起作用的主要是T细胞记忆反应。噬菌斑试验实验证明了再感染时，病程得到有效的控制。对细胞类型频率进行分析发现同型和异型病毒再感染后免疫细胞（髓样，T/NK，B，粒细胞）都发生了积累。在X31感染后，T & NK细胞频率甚至更高，同时骨髓细胞大量但短暂的积累，提示我们T细胞介导的应答在不存在抗体的情况下发挥更大作用。实验团队比较了对IAV感染的初次应答和二次应答后亚群丰度的变化。与原发性感染一样，干扰素刺激的中性粒细胞亚群立即积聚，并在感染后5天内保持升高的水平。在同源感染，IFN刺激的MDM迅速积累，但单核细胞只有轻微增加，在异源再次感染，都大幅增加。考虑到骨髓细胞的总比例在dpi60，dprc2，dprc5相似，提示我们在同源毒株再感染之前已经在RM内的MDM快速应答起来了。Th 1 CD 4 + T细胞在2dprc升高，但效应CD 8 + T和TRM细胞的积累较慢。此外无论再次感染的毒株是什么，循环的基底细胞丰度没有任何变化。当然可能那些变化不明显的细胞亚群需要更长的采样时间点，也可能需要必要的炎症阈值。总之似乎异源再感染后诱导的作用更大。细胞亚群的差异表达分析，以评估细胞状态的变化，并发现效应髓细胞和T细胞亚群之间几乎没有实质性差异。
上面探讨了丰度和基因水平上原发性和继发性反应之间的特定差异，接下来实验团队探讨RM整体组织性反应变化。实验团队将记忆和再感染的在感染的样本映射到先前原发感染RM的PC分析中: 60 dpi与naïve分离，并且与2dpi相似，明即使IAV在14 dpi时被清除，鼻粘膜的组成仍持续显著变化。横向上，X31再感染的样品的普遍位于左侧，与8 dpi重叠。纵向上PC 2没有显著的变化，表明在再攻击时发生增强的效应免疫应答，但在所有细胞类型中没有广泛的抗病毒活化。此外比较PR8与X31二者再感染，我们发现PR 8 5 dprc时，基本恢复到60 dpi，表明反应已基本消退。然而X31在5 dprc时仍发生高水平的免疫浸润。为了量化时间点之间的总体差异，实验团队计算了所有样品之间的组成Aitchison距离。在原发性感染中，RM逐渐与naive态分离，峰值在8dpi。但随后随着感染消退而变得更接近。之前提到鼻粘膜60 dpi虽然病毒清除，但是仍与其naive状态不同。PR 8再感染后，组成也不同于60 dpi。然而，该差异的程度小于naive与5 dpi和8 dpi之间的差异，表明记忆应答更简洁。相比之下，X31感染导致最大的距离增加，这结果凸显了在没有抗体介导的保护的情况下诱导的免疫细胞的大量积累。将初次感染时间点与峰值记忆应答进行比较，每个初次感染时间点与2dprc不同，表明先前的感染将RM应答重塑了IAV感染。总之，我们提供了IAV感染和再感染期间关键免疫和上皮细胞应答的时间轴，说明在初次感染中观察到的许多逐步变化在再感染后更加协调和加速。
