一、举例回顾
本节下载GSE1009数据集，使用limma包进行差异分析举例。
GSE1009
样本量：共6个样本，其中后3个为糖尿病肾病(DN)肾小球样本，前3个为正常肾小球样本。
使用芯片：Affymetrix Human Genome U95 Version 2 Array。
平台：GPL8300。
二、需要准备的文件：
上一节中保存的GSE1009.Rdata和GSE1009expressionmetrix_GSE.csv（请把这两个文件放在一个文件夹中。）
三、差异分析代码解析：
>setwd("D:\\Rfile")
>rm(list = ls())
>options(stringsAsFactors=F)
#老规矩，先设置工作目录。
>load(file = 'GSE1009.Rdata')
#加载上一节保存的R文件，里面包含表达矩阵和分组信息，不记得了可以看看上一节代码。
>table(group_list)
#计数每组样本的个数。
>library(limma)
#调用limma包，注意调用包之前，请先安装。
#limma包是biocondutor中的包，搜索安装命令的方式见上一节，这里就不重复了。最新的安装命令如下：
>logFoldChange=1
>adjustP=0.05
#设置差异基因DEGs的筛选阈值。
#关于筛选阈值：一般有三个筛选条件，log2FC、P、FDR(调整的P),大家可以根据自己的需要设置。
>rt=read.csv("GSE1009expressionmetrix_GSE.csv")
#读取整理好的表达矩阵数据，读入R中的矩阵的数据结构为列表，将整个列表赋值给变量rt.
>rt=as.matrix(rt)
#将列表rt转换为矩阵。
#这时表达矩阵如下：
>rownames(rt)=rt[,1]
#将第一列数据（基因名）作为行名。
>exp=rt[,2:ncol(rt)]
#选择第2列到最后一列，即表达矩阵，并赋值给exp。这样就得到行名为基因名，列名为样本名的矩阵。
>dimnames=list(rownames(exp),colnames(exp))
#提取出exp的行名和列名。这里的dimnames就是矩阵创建matrix里面的参数，在数据结构矩阵那一节有讲。
>rt=matrix(as.numeric(as.matrix(exp)),nrow=nrow(exp),dimnames=dimnames)
#合并整个矩阵，得到一个行名为基因名，列名为样本名的表达矩阵。
>modType=c(rep("Control",3),rep("DN",3))
#构建分组模型，根据GSE1009样本的排列，前3个为正常样本，后3个为糖肾样本，构建一个分组的向量模型。
>design <- model.matrix(~0+factor(modType))
>colnames(design) <- c("Control","DN")
#创建线性模型。
#注意这里，在构建模型时，有一些数据集的处理组在前，对照组在后，且因为R里面默认的字符存储顺序为字母表顺序，如果处理组的首写字母的顺序在对照组的后面，构建模型时前三个又是处理组，那design出来的结果会上下调就完全相反。所以如果是这种情况的话，需要定义因子顺序。如：“modType=c(rep("DN",40),rep("Control",40))
design <- model.matrix(~0+factor(modType,levels = c("DN","Control"),ordered = F)).”
>fit <- lmFit(rt,design)
>cont.matrix<-makeContrasts(DN-Control,levels=design)
>fit2 <- contrasts.fit(fit, cont.matrix)
>fit2 <- eBayes(fit2)
>allDiff=topTable(fit2,adjust='fdr',number=200000)
#贝叶斯检验。
>diffSig <- allDiff[with(allDiff, (abs(logFC)>logFoldChange & adj.P.Val < adjustP )), ]
#根据筛选条件筛选出差异基因。
>diffUp <- allDiff[with(allDiff, (logFC>logFoldChange & adj.P.Val < adjustP )), ]
#筛选上调的基因。
>diffDown <- allDiff[with(allDiff, (logFC<(-logFoldChange) & adj.P.Val < adjustP )), ]
#筛选下调的基因。
##如果想把这些基因的结果输出，可以用write.table函数write.table(diffUp,file="up.xls",sep="\t",quote=F,row.names=F)，要基因名字就把参数row.names设置为T.
##绘制热图
>group<-modType
#设置热图的分组。
>group<-as.data.frame(group)
>rownames(group)<-colnames(rt)
#按照分组，将rt的列名改为DN或control
>heat<-rt[rownames(rt) %in% c(head(rownames(subset(diffSig,diffSig$logFC>0)),20),head(rownames(subset(diffSig,diffSig$logFC<0)),20)),]
>library(pheatmap)
>x <- t(scale(t(heat)))
>pheatmap(x,annotation_col=group)
#绘制前20个基因的热图，自己调整基因数、图形颜色等等。
##绘制火山图
>png(file="火山图.png",width = 600,height = 600)
#设置图片格式
>yMax=max(-log10(allDiff$adj.P.Val))
#定义y轴最大值
>xMax=max(abs(allDiff$logFC))
#定义x轴最大值
>plot(allDiff$logFC,-log10(allDiff$adj.P.Val), xlab="logFC",ylab="-log10(adj.P.Val)",main="Volcano", xlim=c(-xMax,xMax),ylim=c(0,yMax),yaxs="i",pch=19, cex=1.2)
#绘图
>diffSub=subset(allDiff, adj.P.Val<adjustP & logFC>logFoldChange)
>points( diffSub$logFC,-log10(diffSub$adj.P.Val), pch=19, col="red",cex=1.2)
#修改上调基因的图形参数
>diffSub=subset(allDiff, adj.P.Val<adjustP & logFC<(-logFoldChange))
>points(diffSub$logFC,-log10(diffSub$adj.P.Val), pch=19, col="green",cex=1.2)
#修改下调基因的图形参数
>abline(h=-log10(adjustP),lty=2,lwd=2)
>abline(v=c(-1,1),lty=2,lwd=2)
#拼接图形
>dev.off()
#返回终端。
所有代码如下：
整个分析中的变量如下：
至此，DEGs分析以及火山图和热图就完啦，下一章是富集分析。
