Kallisto下游推荐的分析软件是Sleuth，所以我们本次介绍如何使用Sleuth进行相关的分析。
RNA-seq在完成转录本的鉴定及定量后，我们经常做的分析之一就是差异表达。通常我们使用较多的有以下工具：
而Kallisto主要推荐的下游分析软件是Sleuth这个R包。Sleuth与其他常用的包进行比较其结果还是很不错的。
下面我们来介绍一下该包的使用。
Sleuth的安装
source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite("rhdf5")
install.packages("devtools")
devtools::install_github("pachterlab/sleuth")
如果你安装了conda，也可以通过命令行的方式安装conda install --channel bioconda r-sleuth
Sleuth的使用
#设置kallisto生成的路径
base_dir <- "/home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output"
#获取所有的simple_id,具体可以看一些file.path命令的使用
sample_id <- dir(file.path(base_dir))
sample_id
## [1] "WT_1" "WT_2" "WT_3" Mutation_1"
## [5] "Mutation_2" Muatation_3"
#获取结果文件的路径
kal_dirs <- sapply(sample_id, function(id) file.path(base_dir, id))
kal_dirs
## WT_1
## "/home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/WT_1"
## WT_2
## "/home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/WT_2"
## WT_3
## "/home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/WT_3"
## Mutation_1
## "/home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/Mutation_1"
## Mutation_2
## "/home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/Mutation_2"
## Mutation_3
## "/home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/Mutation_3"
#读取实验设计表
s2c <- read.table("./design_matrix.txt", header = TRUE, sep='\t',stringsAsFactors=FALSE)
s2c
## sample condition reps
## 1 WT_1 WT 1
## 2 WT_2 WT 2
## 3 WT_3 WT 3
## 4 Mutation_1 Mutation 1
## 5 Mutation_2 Mutation 2
## 6 Mutation_3 Mutation 3
#与路径合并
s2c <- dplyr::mutate(s2c, path = kal_dirs)
print(s2c)
## sample condition reps
## 1 WT_1 WT 1
## 2 WT_2 WT 2
## 3 WT_3 WT 3
## 4 Mutation_1 Mutation 1
## 5 Mutation_2 Mutation 2
## 6 Mutation_3 Mutation 3
## path
## 1 /home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/WT_1
## 2 /home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/WT_2
## 3 /home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/WT_3
## 4 /home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/Mutation_1
## 5 /home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/IMutation_2
## 6 /home/617/sleuth_analysis/kallisto_qaunt_output/Mutation_3
#获取转录本ID信息
#方法一：基于biomart
library(biomaRt)
#change to genename
mart <- biomaRt::useMart(biomart = "ENSEMBL_MART_ENSEMBL",
dataset = "hsapiens_gene_ensembl",
host = 'ensembl.org')
t2g <- biomaRt::getBM(attributes = c("ensembl_transcript_id", "ensembl_gene_id",
"external_gene_name"), mart = mart)
t2g <- dplyr::rename(t2g, target_id = ensembl_transcript_id,
ens_gene = ensembl_gene_id, ext_gene = external_gene_name)
#方法二：下载EnsDb.Hsapiens.v75或者其他版本相应的R包
library('EnsDb.Hsapiens.v75')
library('ensembldb')
mmsdb<- EnsDb.Hsapiens.v75
tx.mms<- transcripts(mmsdb, return.type = "DataFrame")
tx.mms<- tx.mms[, c("tx_id", "gene_id")]
gene.mms<- genes(mmsdb, return.type = "DataFrame")
gene.mms<- gene.mms[, c("gene_id", "symbol")]
tx2genes.mms <- merge(tx.mms, gene.mms, by = "gene_id")
t2g <- tx2genes.mms[, 2:3]
#方法三：自己制作相应的txt文件第一列为target_id，第二列为对应的gene（可以用ID或者是Symbol）
t2g <- read.table("./t2g.txt", header = TRUE, stringsAsFactors=FALSE)
#读取Kallisto结果文件
#如果之前在kallisto quant没有设置-b参数该步会报错
library(sleuth)
so <- sleuth_prep(s2c, ~ condition, target_mapping = t2g, extra_bootstrap_summary = TRUE)
#如果想要将一个基因的不同转录本合并，可以按照以下模式导入
so <- sleuth_prep(s2c, ~ condition, target_mapping = t2g, extra_bootstrap_summary = TRUE,gene_mode=T,aggregation_column = 'ext_gene')
#建立模型，该步通过依据不同实验条件下（WT与Mutation）的数据构建线性模型，以“smooth”每个样品的原始kallisto丰度估计值。
so <- sleuth_fit(so)
#为了鉴定不同组差异表达的转录本，sleuth进行第二次拟合即“reduced”模型，该模型假设两种条件下的丰度相等。然后Sleuth将识别与“full”模型明显更好拟合的转录本，即在假设丰度相等的情况下与reduced模型拟合度低，而加入变量不同的实验条件后与full模型的拟合度高，说明该转录本/基因表达有差异。
so <- sleuth_fit(so, ~1, 'reduced')
#Sleuth采取 likelihood ratio test(LRT) 进行鉴定
so <- sleuth_lrt(so, 'reduced', 'full')
#可以使用models()查看不同的模型
models(so)
## [ full ]
## formula: ~condition
## coefficients:
## (Intercept)
## conditionWW
## [ reduced ]
## formula: ~1
## coefficients:
## (Intercept)
# LRT检验结果
sleuth_table <- sleuth_results(so, 'reduced:full', 'lrt', show_all = FALSE)
sleuth_significant <- dplyr::filter(sleuth_table, qval <= 0.05)
#Sleuth还提供了Wald test。该函数计算每个转录本上一个特定'beta'系数的Wald检验;这提供了β值，它们是成对比较的fold change偏差值。
so <- sleuth_wt(so,'conditionWT','full')
results_table <- sleuth_results(so, 'conditionWT', test_type = 'wt')
sleuth_significant <- dplyr::filter(results_table, qval <= 0.05)
#如何导出基因表达量TPM
sleuth_geneexp<-sleuth_to_matrix(so,'obs_norm', 'tpm')
以上就是Sleuth 的应用。如果你依然还是想要使用经典的DESeq2，你可以这样导入文件：
library(tximport)
library(DESeq2)
txi<-tximport(files=kal_dirs,type='kallisto',tx2gene=t2g)
dds1<-DESeqDataSetFromTximport(txi,s2c,~condition)
然后就可使用DESeq2进行下游的分析。
