转发自http://crickcollege.com/news/233.html
写在前面
从10月底开始，由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂正式开班了！整个课程由21堂大课组成。作为蛋白质组学纯小白一枚，小编也打算借这个机会好好学习感受一下。继第一讲“蛋白质组学研究方法概述”和第二讲“蛋白质谱实验样品前处理”之后，小编再接再厉，整理了第三讲“蛋白质谱的原理及使用”的听课笔记，分享给各位。
前面跟大家分享了质谱仪的原理、性能参数，以及串联质谱仪的工作方式，错过的小伙伴请戳：
听课笔记之蛋白质谱的原理及使用（一）
听课笔记之蛋白质谱的原理及使用（二）
听课笔记之蛋白质谱的原理及使用（三）
今天是第三讲听课笔记的最后一篇，小编要跟大家分享的是质谱仪、纳升液相色谱和液质联用系统的使用与维护，以及如何对质谱系统的运行状态进行评估。
授课老师
这次课程的授课老师是来自中国农业大学生物学院的李溱老师。李老师于1999年本科毕业于北京师范大学，2007年于美国德克萨斯州Texas A&M大学获得博士学位，2008年-2009年在University of Illinois at Urbana-Champaign从事博士后研究。于2011年加入中国农业大学生物学院，任副教授，在植物生理学与生物化学国家重点实验室及中国农业大学“985”功能基因组中心生物质谱实验室工作，负责生物质谱实验室日常运行，对外提供蛋白质组学和代谢组学技术服务，并开展基于高分辨质谱技术的植物代谢组学和蛋白质组学研究工作。李老师对各种质谱仪器的原理、特点及运行维护有着非常丰富的理论积累和实践经验，很有幸能邀请到他为我们介绍蛋白质谱的原理和操作。
（文中所有图片均来自李溱老师的讲义，并获得发表授权。）
本次课程的内容分三大部分：
质谱仪的原理、使用与维护
纳升型液相色谱仪的使用与维护
生物质谱运行状态的评估
质谱仪的使用与维护
之前我们讲到了质谱仪主要分为以下五个部分，那么我们就分别针对这些部分来讨论一下使用中可能遇到的问题。
质量分析器
包括mass analyzer和mass filter。对于质量分析器的使用和维护，主要有以下几个要点：
1、 对分辨率和质量准确性进行校正。
这个怎么做呢？最简单的办法就是，每天我们对数据采集中的背景信号进行评估。
比如我们发现，每天质谱图的背景噪音中445.12003处都有一个峰，这应该是空气中硅酮或者装修材料导致的。通过评估这个峰的宽度和质量准确度，我们就能知道质谱的质量轴不是发生了漂移。除此以外，还可以用质量校正液对质量准确性进行评估，这个根据质谱仪的现状，可以每天做，或者每周来做。
2、 评估灵敏度
最简单的办法是做一个标准品，看看它的信号强度有多强，通过这个来评估质谱仪的灵敏度。如果发现灵敏度变差了，我们就要考虑是否有污染，或者某个参数设置错误。
3、 检测质量隔离的准确性以及离子传输/碎裂效率的评估。
这对QE质谱仪来讲，可能是更加明显的问题。在质谱仪做二级的时候，我们是利用四级杆对母离子进行选择，如果质谱仪的设置参数有问题，它对母离子的选择就会发生偏差。比如我们想让它选择质荷比为300的离子，结果它选择出来的是298的离子，就会产生错误。
还有一个问题，质谱仪不能把所有质荷比为300的离子都选择进来，在传输过程中会产生一些损失。针对传输效率，我们需要通过一些实验来分析。最简单的办法还是做一个标准品，通过标准品来看二级谱图的质量与之前运行得比较好的数据相比，是不是变差了。如果变差则说明离子传输的效率可能下降了，就需要通过校正液等，对参数性能进行校正和评估。
比如QE，就有专门的校正和评估程序，来检测传输效率是不是发生了下降。如果下降了，就需要清洗离子源、四级杆，或者传输系统，恢复它的性能。
真空系统
1、 每天需要检查初级真空和高真空的读数
这个是非常重要的，最好每天检查两至三次。质谱仪中的大部分问题都是与真空系统有关的。
2、 每天检查泵油液面、颜色和温度。
为什么需要检查泵油呢？下图红圈标记的地方是QE机械泵的一个窗口，可以用来检查泵油的颜色和液面。窗口旁边有两条线，分别是液面上限和下限，停机状态的时候泵油会高一些，显示比上限的刻度多一点，启动起来以后液面会下降一些。
如果泵油太多，泵会“打嗝”，从废气管排出多余的泵油；泵油太低的话，散热会出现问题。所以需要保证泵油是在两个窗口线之间的。
泵油的颜色是另外一个很关键的指标，它能体现出泵油受污染的程度。新的泵油，比如现在常用的GS495合成泵油，未使用前是黄色的，随着使用时间增长，它会慢慢变成褐色。其它质谱仪，可能会用到Inland19泵油，未使用前是完全无色透明的，随时使用时间的增长，它也会变成褐色。当泵油变成褐色以后，实际上是在告诉我们，它的使用寿命到期了，应该换掉了。换泵油的频率通常是半年一次。
泵油的温度也是重要的指标。泵在工作的时候，泵壳温度在70℃左右，如果泵的温度过低，表示泵的负荷不足，如果温度过高，则很可能泵的某个部位发生了严重的磨擦或者摩损。有一定经验以后，我们可以用手摸一摸泵壳，如果感觉有点烫手，那个温度就是对的，如果非常烫手，那可能泵已经过热运行了。
3、 每周开震气阀震气15-30min
这个工作也很重要。如果不震气，很可能会导致泵的早衰。为什么会出这个问题呢？我们先来看下图：左侧整体图中红色框起来的地方就是泵的入口，右边是它放大以后的照片。
泵的入口对着的就是ESI的喷针，喷针会以200nL/min的速度往泵里面喷乙腈和水，这些乙腈和水被泵抽走之后，就会通过废气管进入到泵油中，乙腈可以与泵油混溶，导致泵油越来越稀，而水是不会与泵油混溶的，只会与泵油产生一种“水火不相融”的效果，使泵油乳化。这些很热的水会在泵里面流动，腐蚀铸铁的泵头，导致泵头的缝隙变大，但泵的工作效率下降。可见，定期震气是必须要做的重要工作。
那么震气是怎么操作的呢？机械泵上会有一个震气阀，震气阀的目的是将新鲜的空气从此处抽到泵里面去。空气进入泵以后，会将泵油中的水蒸气（或者说湿气）带走，通过废气管排出来。水分排出来以后，泵的腐蚀就会得到控制了。
另外，我们要知道，与泵油互融的乙腈是没办法除掉的，所以我们需要每半年换一次泵油，来减少乙腈对泵油的污染。
4、 定期检查漏油情况
泵漏油是经常发生的，尤其是使用超过五年以后，漏油基本上是必然的。这个油会漏到哪儿去呢？通常比较好的质谱仪，比如QE，会有一个接油的盘子。其实当我们看到盘子里有油的时候，油已经漏了很久了。所以我们应该经常趴下来看看油壳的底部是否有油渗出来，如果有，就应该及时维修，防止因为漏油过多，造成泵里缺油，导致泵运行的质量就会越来越差，最后机械泵就会被烧坏。
5、 注意机械泵和涡轮泵运行噪声的变化
这是一个很微妙的过程。我们知道，新买来的机械，运行的时候噪音非常小，运行起来很安静。随着仪器的老化，它的声音会逐渐变大。但如果运行过程中噪音突然变大，则表示泵出现了一些故障，这时就需要关注真空度或者其它一些参数，看看泵的性能是否发生了变化。
尤其是涡轮泵，运行时如果出现了一个非常尖的类似哨音的噪音，就说明涡轮泵出现了一些故障，需要密切监视涡轮泵运行的真空度或者其它参数。如果发现了故障，可以第一时间排除，而不要等整个泵都坏了再维修，那就很耗时间了。所以泵噪音的变化，是一种快速的信号，可以提醒我们注意监视泵的运行情况，尽早排除故障或进行维修。
6、 检查仪器运行日志（log）中记录的运行参数
QE质谱仪每15分钟会自动记录一次仪器的运行参数，这个记录我们可以每天或每周查看，如果发现里面的参数突然发生了大的波动或变化，则表明相关的设备可能发生了故障，特别是与涡轮泵有关的电压、温度或工作电流等。
另一个我们常见的问题就是真空度报警。各个质谱仪都有可能出现真空度过高或过低的问题。泵损坏了会直接导致真空度过高。另外，毛细管离子传输的入口受了损伤，变大了，或者说没有拧紧，导致漏气，也会导致真空度过高。反之，当毛细管被堵塞时，会导致真高度过低。（后面会举一个例子，一只蚊子把毛细管出口堵住了，拿走蚊子以后真空度恢复正常。）
离子源和离子传输系统
1、 喷针的清洗
喷针的洁净度对喷雾稳定性的影响是很大的。前面介绍过，喷针是非常细的，长度大概是3-5mm，针尖的内径和外径不到10μm。样品通过针尖喷出去的，因为这里有高压，而且毛细管会有300℃的高温，如果样品在针尖处残留，我们肉眼是看不到的，但会导致喷针形成不了连续的喷雾，而是会形成断断续续的喷雾，或者很小的液滴。如果出现这种情况，就表示喷针的针尖污染了。
如何清洗呢？通常是用甲醇，也可以用异丙醇与水的混合溶液冲洗针尖，如果还是没办法把污染物洗下来，就只能换一个喷针了。质谱仪通常用的是不锈钢的喷针，这种喷针非常软，清洗的时候一定要小心，否则容易把喷针碰歪，就不能再继续使用了。
下图是一个比较极端的例子，一只蚊子跑了进去，把离子源出口堵住了，还把针尖碰断了。
2、 离子传输毛细管的清洗
传输毛细管其实就是从大气压到质谱仪真空状态的一个渐变。进入质谱仪的所有样品，离子、空气、溶剂分子，都要经过它，所以它很容易发生污染。另外，毛细管的洁净度又会影响粗真空，如果毛细管很脏，真空度就会下降，还会导致灵敏度的降低。
通常情况下，毛细管的温度是很高的，我们需要把它冷却以后，再拆掉清洗。
上图红色圈出来的就是毛细管的位置。拆掉以后的毛细管如下图：
毛细管开口处的直径通常不到1mm。将毛细管组装上去以后，如下图，红色和橙色圆圈分别标记了毛细管的入口，以及它穿过质谱仪的出口。离子通过毛细管，进入到S-Lens。
3、S-Lens的清洗
S-Lens可以看作是离子源的一部分，功能是聚焦离子。它的结构是由13片不同的铁片组成，通过下面的横截面图，我们看到它的每个铁片上有一个圆圈，而且这13个圆圈的大小是不一样的，靠左侧的圈大一些，靠右侧的小一些，离子是从左边进来，往右走的过程。
当离子进入S-Lens以后，空气中其它的污染物也容易一起带进来，开始经过的是大圈，通常不会堵在圈上，再往后圈变小，空气中的污染分子就容易打到这些小圈上，使S-Lens发生污染。所以需要定期清洗。比如下图中拆下来的这个铁片，中心的圈周围那一片灰色的东西，就是污染物堆积而形成的。
清洗的方法是使用1% Liqui-nox超声清洗，这是一种非常好用的清洗液。S-Lens的清洁度对灵敏度的影响是很大的，尤其是在做小分子的时候，S-Lens的污染很可能会导致信号丢失。所以如果发现质谱没有信号出来，可以先清洗一下S-Lens看看。
气体系统、计算机及供电系统
1、 气体系统
质谱仪在碰撞池里是需要充高纯度的氮气或者氦气的，这部分由供气系统来完成。一般情况下，我们要求4个9（即气体的纯度大于等于99.99%）的高纯氮或者高纯氦，在保证纯度的前提下，还要保证有一定的压力。
2、 计算机
目前高分辨质谱仪产生的数据量是非常大的，一小时产生500M-1G的数据很常见，所以每天可能会产生20G数据，一个月就有600G，硬盘很容易装满。所以我们一定要注意定期备份和删除数据，保证有足够大的硬盘空间来存放我们的实验数据。
3、 供电和空调系统
液质联用系统需要一个稳定的电源。如果供电系统不稳定，会导致很多问题。比如，电源不稳定会引起零地电压不稳，导致液相色谱不能给质谱仪准确的开始信号，使得它们无法同步，最终导致液相色谱与质谱的通讯发生错误。
另外，实验室的温度、湿度和洁净度，对于保证质谱仪在一个稳定的环境中运行，也是非常重要的。
散热系统
最后，对质谱仪的散热系统也需要进行除尘处理。QE有一个通风口，用来往里抽空气，达到通风散热的效果。通风口也可能被空气污染物堵塞，导致散热效率下降，所以需要定期清洗。
纳升液相系统的使用与维护
上面介绍了质谱仪在使用中的注意事项，接下来我们学习一下纳升液相色谱的使用与维护。
流动相和洗针液
1、流动相：纳升液相色谱有一个很大的特点，就是它的流动相消耗量非常少。我们可以计算一下，它的流速是在0.2-0.3μL/min，所以一个小时只会消耗十几微升的流动相，一天的用量也不会超过0.3mL的量。而一个溶剂瓶通常能装30mL的溶液，算下来可以用100天。
但是我们却不可能真正用到100天。因为流动相里的一些成分会挥发，比如乙腈、甲酸，而且水相可能会被污染，这些都会导致流动相变质。因此，我们需要严格注意并定期更换流动相，来防止流动相的挥发和微生物的滋生。
我们见过一些比较极端的情况，把溶剂瓶里的流动相倒出来后，发现瓶身上会有一圈白道，这就是长时间不更换溶液，里面长了大量的微生物形成的，这些微生物的代谢物会严重污染样品，造成分析结果很不准确。
2、洗针液：在使用洗针液时，要确保样品不被弱洗液洗脱，使用的强洗液要能彻底清洗进样系统，防止残留和交叉污染。
进样瓶
进样瓶的材料很重要，要求对样品的吸附很弱，所以通常使用塑料瓶，它比玻璃瓶的吸附力更弱一些。而且应该选尖底的塑料瓶（比如像下图这样的），可以保证最后一点溶液也能被进样器吸走。尖底瓶可以将最后残留的溶液控制在4μL以内。
另外就是对自动进样器的温度进行控制，通常控制在8℃左右。可能你会问，为什么不能控制在4℃呢？4℃的时候，空气中的水分会在进样器内部凝结，造成进样器结露，8℃就没有这个问题。
这里需要特别注意的是，做纳升液相色谱，通量是非常低的，往往一天只能出十几个样品，也就是说，虽然我们的自动进样器是96位的，甚至更多，可以容纳很多样品，但是并不等于自动进样器可以当成冰箱来使用。如果你的样品比较多，在前处理完成后，都应该放到冰箱里，而进样器里只放一天能做的样品数，比如十几个。没必要把更多的样品都放到自动进样器里，这样可以缓解进样器的负担，也能避免样品因为自动进样器发生了故障或者温度太高时产生降解。
系统压力
系统压力是非常重要的部分。我们先来看看下面的柱压曲线图：
柱压曲线可以很直接地反映出液相色谱系统是否正常。有操作经验的小伙伴都知道，液相色谱系统很容易发生堵塞，检查到底是哪里堵了，为什么会堵，都是非常头痛的事。那么，如何来及时发现色谱可能会出现的堵塞或者故障呢？这时候我们就可以好好利用柱压曲线来分析了。
上图中上面那条是正常情况下的曲线，分为两段，第一段（最左侧有两次大的起伏那一段）叫traping。这段实际上就是保留样品打到Trap柱上，用高水相（99%的水）和比较高的流速（2-5μL/min）来冲洗，把样品中的盐和其它杂质除掉，于是形成的这么一段压力变化图。
然后我们用0.2μL/min的速度开始跑梯度，跑完梯度就产生后面那一段较长的曲线，我们会看到压力会呈现出逐渐升高，再快速降低，再升高的过程。
第一段traping区，产生了一小段平稳的峰，这表示样品的盐已经被除掉了。而像下面那条曲线中的traping阶段，峰型明显不如第一张图平稳，出现了压力升高的现象，这表明样品中可能会有杂质在trap过程中被流动相慢慢地带到柱子里，而且会留在柱子上，导致柱上局部地堵塞。这种情况下说明样品前处理是有一些问题的，样品处理得不是很干净。
如果像第二张图中显示的那样，在traping阶段出现了压力变高的现象，则很可能样品中的杂质进入到了分析柱中，把分析柱堵了。这种情况下，在做完实验后，可以用相对高浓度的乙腈彻底地冲洗色谱柱，把里面的杂质冲洗干净。
在第二段，压力应该是慢慢地升高，然后降低，再升高的。因为99%水相的时候，压力是比较高的，而乙腈混合物中当水的浓度为80%-90%的时候，压力会慢慢上升，之后，随着乙腈浓度的升高，压力会有下降的过程，最后再回到比较高的压力水平。如果整个柱压曲线符合以上的变化规律，则说明整个过程是没问题的。但如果样品压力突然大幅度降低，表示管路的接头可能发生了断裂，这个也是需要特别我们留意的信号。
色谱柱超压和漏液
色谱柱如果压力过大，就超压报警。那么超压产生的原因可能有哪些呢？
酶解以后没有离心，或者胶没有处理好，样品颗粒或胶颗粒进来以后，将色谱柱堵塞；
有杂质把进样六通阀损坏了，这些杂质可能会从六通阀里被冲出来，堵住柱子；
没有裁剪整齐的石英毛细管。
说到石英毛细管的裁剪，这绝对是个技术活。我们知道，做柱子的时候要用石英毛细管进行连接，而连接处是不能直接拧到色谱柱的接头处的，需要通过一个套管，先把毛细管切了，再用套管来接。切割毛细管的工具通常是陶瓷片，切的过程中很容易产生一些碎片。而且毛细管的内径只有100μm多，外径也只有360μm，这么细的管子，切的时候需要内管和外面包覆的聚合物层一起切，这种聚合物材料的包覆层也容易切出毛边。这些毛边和碎片，很容易进到色谱柱里，造成堵塞。
这个问题怎么解决呢？我们需要升级一下裁剪工具，比较建议大家使用下图的毛细管切割器。价格有点贵，3000多人民币，但切出来的口是非常整齐的，如果经常需要用的话，可以考虑买一个。用毛细管切割器可以很有效地解决毛边的问题。
除了超压，另一个可能出现的问题就是漏液，这个我们该怎么检查呢？常用的办法是用pH试纸。因为我们使用的99%的水和0.1%的甲酸，是酸性溶液，我们用pH试纸把整个管路接口检查一遍，如果发现试纸变成红颜色，则说明有漏液。
还有一个需要我们注意的问题，就是纳升液相色谱的套管和接头。我们先来看一张实物图：
通常，液相色谱仪的管路都是1/16’的管路（即管路内径是1/16’英寸，大约1.6mm），而石英毛细管的外径是360-380μm，显然它们是不兼容的，也就是说，我们如果直接将毛细管装到管路接头处，会留有很大的缝隙，所以需要套管才能把两者紧密地接上。在进行管路连接时，我们需要保证套管的前沿与毛细管的前沿是并齐的，且是没有缝隙的。一旦有缝隙，会形成一个叫“死体积”的空间，导致色谱峰的变化。
另外，纳升液相色谱中使用的三通接头是1/32’的管路（直径0.8mm），与1/16’的管路也不兼容，所以还需要换一个1/32’的套管，再往上连接。
液相色谱管路使用的接头分两种，一种是PEEK（聚醚醚酮）塑料接头，它能承受的最大压力是5600 psi，另一种是不锈钢接头，可以承受的最大压力为10000 psi，这两种接头承受的最大压力是不一样的。我们在设置液相色谱系统压力时，需要考虑的是承受压力最弱的那个环节。比如，当色谱系统的任何一个接头使用了PEEK材料，则整个系统的压力都不能超过5000 psi，否则当压力过大时，PEEK接头处的套管就很容易从接头处蹦开，导致漏液。我们在设置色谱的系统压力时，一定要确认清楚所有接头的类型。
液质联用系统的检查和保养
接下来我们来说说液质联用系统该如何检查和保养。
每日检查
1） 实验室温湿度：如果实验室温度过高，比较空调坏了，则应该马上停止实验，否则，质谱仪很容易因为温度过高而造成测量结果不准。比如Q-TOF，过热了以后，它的TOF管长度就会发生变化，质谱质量轴就会飘掉，导致结果很不准确。
2） 机械泵油面、工作温度和油壳渗漏
3） 系统真空度（粗真空和高真空）
4） 质谱质量轴：检查我们常看的值是否发生变化，如果有变化，说明质量轴已经不准确了，应该立刻停下实验重新校正。
5）溶剂瓶沉淀检查：晃动并观察溶剂瓶下部是否有絮状沉淀，如果有则说明流动相在溶剂瓶里至少存放了一周以上，应该立刻换掉，甚至应该把溶剂瓶的滤头也换掉，因为滤头里可能会有很多的微生物，而导致样品的交叉污染。
每周保养
1） 质量轴校正：校正的频率根据质谱仪的不同而不同，例如QTOF，校正的频率可能需要更高一些，具体的频率要参考仪器商提供的手册说明。
2） 机械泵震气
3） 离子传输毛细管清洗
4） 流动相，洗针液更换
每月保养
1） 离子传输系统（S-Lens）的清洗
2） 离子传输性能评估和校正
3） 四级杆污染程度评估
半年保养
1） 更换机械泵泵油
2） 清洗四级杆
3） 色谱仪管路清洗：推荐一种“神仙水”，冲洗所有的管路，每次用量为20-50mL。它的配方是：水：甲醇：乙腈：乙醇 = 1：1：1：1
4） 色谱泵柱塞杆，密封垫渗漏测试：测试泵是否可以承受标称的压力，例如标称为10000 psi，那我们可以验证一下是否能做到。再比如，假设我们的方法设定是5000 psi，那我们跑一下试试是否会漏液，如果发现漏液，则说明该泵不能提供5000 psi的稳定压力，在此压力上由于它会漏夜，则流动相的流速测定也是错误的了。
5） 仪器除尘
6） UPS放电
7） 空调系统检修
如何评估质谱的运行状态
TIC图的峰强和峰宽
质谱系统的运行状态我们可以通过TIC图来判断。那么，什么是TIC图？TIC（Total Ion Chromatography）就是总离子色谱图。经色谱分离流出的组分不断进入质谱，质谱连续扫描进行数据采集，每一次扫描得到一张质谱图，每一张质谱图都对应唯一的一个时间点，将每一张质谱图中所有离子强度相加，得到一个总的离子流强度值，然后以离子强度为纵坐标，时间为横坐标，把各个时间点上的总离子流强度绘制出来，就形成了TIC图。
TIC图长什么样子？大伙儿来感受一下：
为了评估质谱运行状态，李溱老师实验室通常是做一个BSA（牛血清白蛋白）的标准品，进样50-100 fmol（对应几纳克的BSA）。拿到TIC图以后，我们可以先来看色谱峰的强度，峰强度与灵敏度有关。完全清洗并安装好的质谱仪，峰的强度可以达到1E8-1E9，如果我们做完后发现强度只有1E7，则说明质谱的灵敏度有问题（这里需要先排除样品的质量有问题）。如果灵敏度是对的，则说明最基本的参数是没问题的。
对应上面的图，很明显可以看到，同样是自制的trap柱，系统彻底清洗后的峰强度，要大于运行一段时间后的值。
接下来看色谱峰的宽度，峰宽度决定了色谱柱的性能。如果发现峰变得异常的宽，比如下面这样的图，则说明色谱柱，尤其是trap柱的性能明显下降，这时候就需要更换trap柱了。
我们回到第一张TIC图，观察一下会发现，大部分情况下色谱图里都会有一个污染峰（红色圆圈标记）。它是怎么来的呢？这就是我们用的EP管、枪头等带来的污染（就是传说中的塑料峰）。第一个图，由于彻底清洗了系统，所以污染峰是比较弱的，当运行了一段时间后会发现，污染峰又变高了，表示样品中的污染在Trap柱中慢慢地积累。这时候可以用90%乙腈的冲洗液来把柱里的污染物洗掉。
然后，我们再比较一下自制trap柱与商业trap柱的峰宽。第一个图的峰宽，通常在0.5-1分钟，当换成商业化的高端Trap柱（1.7μm粒径填料）时，它的峰宽明显要小很多，可以把峰宽控制在10秒左右。（这两组对比实验我们用的是用的是同一根分析柱。）可见，Trap柱的表现对色谱的性能有很大的影响，当使用比较好的Trap柱时，可以把峰宽控制得很窄。
另外我们需要评估的就是搜库的结果，结果的评分以及每条肽段被检测到的次数，可以反映出二级离子的碎裂效率。如果搜库得到的肽段得分都比较低，则说明二级离子的碎裂效率变差，这时需要考虑清洗色谱柱以及离子源设备等。
特别提示：导致色谱峰变宽的另一种可能，是trap柱严重污染引起的。这种情况下，我们会发现一个很神奇的现象，就是搜库结果的评分并不低，有时候反倒会非常高！这是为什么呢？
我们可以来分析一下。色谱峰变宽，代表着出峰时间变长。比如，原来在10秒-30秒可以出峰完的一个肽段，这时候可能需要2-3分钟来出峰。也就是说，该肽段被检测到的次数会增加好几倍，于是搜库软件也会打出的得分也会变高。而这时候得分变高显然并不代表柱效变高了，反倒是柱效下降了。这是一个很有意思的现象。它提醒我们，当察看搜库结果的评分时，一定要综合地判断，如果出现色谱峰变宽，即便评分很高，也不代表是一个好的结果。
异常峰
有时候，我们还会碰到TIC图出现一些很奇怪的峰。在展示不正常的峰之前，我们先来感受两张正常TIC图的画风。
上面两张TIC图分别对应的是一个复杂样品和一个SDS-PAGE条带的简单样品。复杂样品中，我们可以检测到1000多个蛋白，SDS-PAGE条带对应着几十个蛋白。不同复杂度的样品，谱图的画风也是不一样的，通过谱图，我们对质谱仪工作的状态可以有一个了解。通常针对上千个蛋白，或者几十种蛋白，我们能看到的正常的谱图就是这样。
但有时候，我们会碰到一些很奇怪的TIC图，则可以判断色谱或质谱出了问题。比如下面的例子：
可以看到，第一张TIC图在中间偏右的位置，有一系列连续的有规律的出峰，这种说明样品可能受到了PDMS或PEG聚合物的污染。它的特点就是，在质谱图上可以看到有一系列质量相差44、88或者74的污染峰。它们的来源通常是质量比较差的EP管。比如PDMS就是EP管的脱模剂，在制造的时候会涂在模具上，生产好后如果没有清洗干净，就会随着EP管进入样品。如果看到这样的峰，我们就得检查是不是EP管质量不好，下次应该更换质量更好的EP管。
第二张图是一个比较极端的例子，样品可能受到除PEG或PDMS以外的物质的污染，产生了非常强的污染信号，这种污染对于质谱来说是灾难性的，因为它的含量非常高，该信号强度相当于几微克蛋白对应的质谱信号。而且对于纳升液相色谱，所有的样品都是通过喷针进入到毛细管和质谱仪中的，也就是说，大量的污染也都进入到了毛细管和质谱仪中了，这是非常麻烦的事情，需要停机，做彻底地清洗。所以我们一定要使用质量好的EP管以及来源可靠的试剂。
超载
目前的质谱仪，性能已经非常好了，通常我们进样500ng就可以获得很好的鉴定结果，因此不需要盲目地大量地进样，否则就会造成超载的问题。
比如上面第一张图，是正常的进样量，峰宽40秒左右，下面一张图则是盲目进样导致峰非常宽，超过了5分钟。
大量进样到底会造成什么样的问题呢？最直接的影响就是，容易污染离子源，而且在trap柱中不容易被彻底清洗干净，发生拖尾。也就是说，上一样品在trap柱中的残留会污染下一个进样。要解决这个问题，我们又得把整个实验停下来，非常彻底地清洗trap柱，耽误大量的时间。所以对于现在高性能的质谱仪来说，大家尤其不要盲目地增加进样量，这不但不能提高蛋白的鉴定效率，反而只会增加后续清洗的负担。
质谱信号丢失或不稳定
最后，我们来聊一聊当质谱没有信号了，或者信号不稳定的时候，应该怎么办。通常，查找问题的顺序和逻辑是这样的：
首先我们要看有没有背景信号，就是说会不会得到一个基线噪音。如果没有基线噪音，有可能质谱仪系统，读不出任何数据了。下一步我们需要确认，当没有基线噪音时，有没有东西进入质谱仪，或者有没有东西从质谱仪出来：
1） 确认离子源有没有喷雾电压，如果没有喷雾电压，则说明喷雾停止了，没有东西进入质谱仪。如果有的话，比如喷雾电压设为2.0，而质谱检测到的电压为1.96，且还检测到了电流，说明离子源还在工作，有离子进入质谱仪。
2） 当确认了离子源还在正常工作以后，接下来要排除的是质谱仪数据传输故障，也就是说，质谱仪还在工作，能检测到数据，只是无法传输出来。这时可以检测一下质谱仪背后的连接线是否正常连接，有没有出现断开的情况。
3） 如果离子源和数据传输都正常，则很可能是质谱仪本身发生了故障。
4） 最后需要排除的可能是色谱柱发生了堵塞，或者色谱停泵了，导致液相色谱不再传送样品进质谱。这种时候，即便有喷雾电压，也有可能是质谱仪受空气中的污染而产生的电流。
以上就是没有背景信号的情况下最可能发生故障的地方，我们可以一一排查。
如果有基线噪音，却没有样品的信号，则需要排除以下可能：
1） 放错样品瓶。放进色谱的样品瓶里其实没有样品，或者样品装得太少了，进样针够不着样品。
2） Trap柱失效了。Trap柱是用来Trap蛋白的，正常的操作流程是，先用99%的水把蛋白样品打到Trap柱上去，然后再切换到分析柱上，把蛋白样品从Trap柱上洗下来。如果Trap柱失效了，它不能够Trap蛋白，蛋白样品就会被直接洗到废液中去，这样也会导致没有质谱信号。这种情况下我们需要更换Trap柱试试。
3） Trap柱切换阀的故障。这个切换阀决定了流出来的东西是进分析柱还是进废液，如果阀出现了故障，造成样品进不了分析柱，而是一直都只能进入废液，于是也就没有样品可以进入质谱了。
4） 漏液。如果发生漏液，则进质谱的信号会变弱，这种时候应该检测漏液情况。
如果有信号，但信号不稳定：
1） 系统漏液，导致流速变低，使得信号不稳定。
2） 喷针污染，没法喷出连续的气雾，断断续续的，且会在针尖形成液滴。这种时候质谱信号就会很不稳定。我们可以用甲醇或乙醇溶液把喷针冲洗干净再试试，如果还是解决不了，就需要换个新的喷针；
3） 往喷针上供电的接头插得不牢固，也会导致喷雾不连续。这时可以检查一下接头上是否锈掉了，如果有，把锈磨掉，再插上试试。
第三讲“蛋白质谱的原理及使用”听课笔记小编就全部分享完了，非常感谢李溱老师精彩的授课，以及对听课笔记细致的审阅修改！不知道读完整篇的童鞋们，是否有所收获呢？欢迎给我们留言，讲讲你的学习体会、问题或者建议！
诚征稿件
另外，现向广大粉丝征集有关生物信息学方面的高质量推文稿件，无论是数据库、软件工具、算法，还是经验、感悟，只要你认为能够帮助大家的，都可以发给我们。一经录用，稿费从优哦！有意向的小伙伴请在公众号内留言，小编会及时联系你！
关于我们
克里克学院是一家致力于组织生命科学及医学领域科研及应用培训的专业机构，致力于让该领域每一位愿意不断学习和自我提升的科研/临床工作者都能从中找到一系列契合自己需要的专业课程！也让每一位愿意分享和传播自己经验和学识的同行有一个可以充分发挥和展现的讲台！
我们的宗旨
打破高校壁垒，遍请天下名师！
