通过spliced reads的mapping能发现线性RNA和环状RNA的剪切方式不同。一个是正常的5’/3’前后剪切，一个是反向的5’/3’反向剪切(Memczak et al.2013.Nature)。

====建库策略====

环状RNA 测序数据量

• 如果使用环状RNA 建库的策略，建议测序量不低于6G/样本（植物）

• 如果采用普通lncRNA 文库，建议植物的测序量不低于12G/样本，动物则推荐16G/样本以上的测序量。

建库策略的选择

• 如果是环状RNA 未报导的物种，建议优先采用环状RNA 建库的策略，以便对环状RNA有更好的检测效率，发现尽可能多的环状RNA。

• 如果是环状RNA 已报导，且认为目标环状RNA有较高的丰度，同时又特别关心环状RNA 与其他线性RNA 的相互作用关系，则可以考虑使用普通lncRNA 文库的策略。

所以，我们实验的方案都是采用环状RNA建库的。

====鉴定方法========

CircRNA检测的基本原理是去识别反向剪切的位点(back-splice)，最主要的circRNA类型是外显子来源的，当然，在内含子、间区、UTR区域、lncRNA区域以及已知转录本的反义链区域也都鉴定到circRNA，同一个位点可能形成多个circRNA，每个circRNA可能包含一个或多个外显子。CircRNA的数量从几千到几万都有可能。要研究circRNA，鉴定是第一步，也是最重要的一步，目前已经有一些pipeline，鉴定得到的circRNA是否准确和全面，取决于算法的严谨性和可靠性。

根据已发表的文献，环状RNA的鉴定方法分为三类：

1. 从头预测（abinitio）的方法：find_circ（如下图）（Memczaketal., 2013），将不能和基因组比对上读段的两端各取20bp作为锚点，再将锚点作为独立的读段往基因组上比对并寻找唯一匹配位点，如果两个锚点的比对位置在线性上方向呈反向，那么就延长锚点的读段，直至找到环状RNA的接合位置（junction），若此时两侧的序列分别为GT/AG剪接信号，则判断为潜在的环状RNA。

2. 基于RNA-seq比对工具如：Tophat-fusion（KimandSalzberg, 2011）、Mapsplice（Wanget al., 2010）、STAR（Dobinet al., 2013）、segemehl（Hoffmannet al., 2014）等，以寻找融合基因的思想检测环状RNA（如下图）：先将不能比对到转录本上的读段提取出来，再根据软件预测结果找出处于同一条染色体上的融合基因，最后根据基因组注释文件中外显子的边界来判断是否为环状RNA。（这也是目前最常用的方法）

3. 专门为寻找环状RNA而设计的算法和工具（如下图）如CIRI，它考虑了经典的环状RNA以及一些短外显子成环状RNA的情况，同样以GT-AG剪接信号和外显子边界得到环状RNA。

===鉴定方法比较====

2015，NAR发表了来自于丹麦奥尔胡斯大学（Aarhus University）的研究人员（Comparison of circular RNA prediction tools）利用普通的RNA-Seq数据比较了5种常用的环状RNA预测软件（见表1）。

这些算法都依赖外部比对工具，CIRCexplorer和Mapsplice需要有注释信息，其他三种可以不依赖注释信息，但是准确性会有所下降。耗用资源方面，仅finc_circ可以用单机运算(8G RAM)，CIRI耗用资源最多。

测试数据：

物种：人

数据：SRR444655和SRR444975，未用RNaseR处理，该文章中主要用于分析的数据；

SRR444974和SRR445016，使用RNaseR处理，用于验证预测方法预测得到的circRNA准确性的数据。

测序仪器：Hiseq2000，pair-end。

测序量：31.4-41.3GB/样本。

预测结果比较

首先，研究人员用5个软件分别对同一个rRNA-depleted RNA-Seq数据集进行分析。他们发现各个算法给出的环状RNA数目从1500（circRNA_finder）到4000（CIRI）不等，并且只有854个同时被5个软件发现（如下图所示）。

为了验证软件给出的circRNA是否可信，研究人员试图引入线性RNA酶消化（RNase R）的RNA-Seq数据来判断预测到的circRNA是否存在假阳性。

结果显示不同的软件给出的circRNA对RNase R的抵制效率不同，其中，CIRI表现最差，有28.03%的假阳性率（见下图）。

研究人员还关心每个软件预测出的表达量最高的100个circRNA是否真的是环状。他们分别以junction read数目对环状RNA进行排序，观察表达量高的前100个环状RNA是否被线性RNA酶消化。

同样，在CIRI的预测中高表达的环状RNA有超过半数（63%）不可靠。MapSplice和CIRCexplorer是表现最好的两款软件，分别只有9%和6%的circRNA被消化（图下图）。

通过比较现有的circRNA预测软件，我们可以看到不同的算法表现差异较大，用户在使用的时候需要小心。（从venn图也可以看出其实overlap的概率是不高的）

CIRCexplorer和MapSplice输出最可信的circRNA列表，主要的原因是这两个算法依靠已知的基因注释文件，明确的序列注释信息可以帮助他们降低假阳性率，但也限制了这两个软件不能发现de novo的环状RNA。

CircRNA_finder和find_circ也有着很高的准确性，并且这两个软件可以独立于基因注释信息运行，预测全新的环状RNA。

由于单个软件往往在一个方面存在着一定的局限性，且数据表明能够被多个算法预测到的环状RNA有着较高的可信度，因此，在实际项目中，推荐大家多使用两到三个环状RNA预测软件，进而取它们的交集。

对于任意两种方法检测的效果，文中也做了比较：

从图中我们可以看到，两种方法联用可以降低假阳性，提高准确率。

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