写在前面
不知道大家都是怎么完成qPCR的计算的，在不会R的时候，我是用一个祖传的Excel表进行计算的。🤣
但是，一直有个缺点，如果需要计算的量比较大时，就不方便了，去搜了一下文献，发现了一个最近发表的R包，不仅可以计算反转录的RNA体积，还可以帮助选择定量方法，简直是神仙R包，本期就介绍一下它的使用吧。🥰
感谢原作者的开发，嘿嘿，文末有引用方法。👀
用到的包
rm(list = ls())
library(tidyverse)
library(ggsci)
library(qPCRtools)
library(ggstatsplot)
计算反转录用的RNA体积
3.1 示例数据
包内自带了示例数据，这里我们就直接加载吧。🥳
df.1需要至少2列，sample和concentration，剩下的大家随意。🤣
Note! 这里浓度默认是ng/ul。🤜
df.1.path <- system.file("examples", "crtv.data.txt", package = "qPCRtools")
df.1 <- data.table::fread(df.1.path)
head(df.1)
Note! 这里我们的df.2文件至少要包含一个all的列，告诉R具体的反应体积。🤒
df.2.path <- system.file("examples", "crtv.template.txt", package = "qPCRtools")
df.2 <- data.table::fread(df.2.path)
head(df.2)
3.2 开始计算
现在我们就知道每个sample该如何配置反转路体积啦，Perfect!😁
这里我们假设反转1ug。🤩
result <- CalRTable(data = df.1, template = df.2, RNA.weight = 1)
head(result)
相对标准曲线和扩增效率的计算
拿到新的Primers应该先进行扩增效率的计算，一起看下怎么弄吧。👇
4.1 示例数据
df.1包含至少2列，孔的位置和Cq值。😗
df.1.path <- system.file("examples", "calsc.cq.txt", package = "qPCRtools")
df.1 <- data.table::fread(df.1.path)
head(df.1)
df.2包含至少2列，孔的位置和浓度。🫠
df.2.path <- system.file("examples", "calsc.info.txt", package = "qPCRtools")
df.2 <- data.table::fread(df.2.path)
head(df.2)
4.2 开始计算
Note! 大家注意一下这里的稀释倍数，默认是4，可以按需更改。😂
CalCurve(
cq.table = df.1,
concen.table = df.2,
lowest.concen = 4,
highest.concen = 4096,
dilu = 4,
by = "mean"
) -> p
p[["table"]]
4.3 可视化
p[["figure"]] +
theme_bw()+
scale_color_npg()
使用相对标准曲线法计算基因表达水平
如果内参基因和目的基因的扩增效率不相等，我们就不能使用2-ΔΔCt法了，需要选择无参的方法。🤨
5.1 示例数据
cq.table至少包含position和Cq值。😘
df1.path <- system.file("examples", "cal.exp.curve.cq.txt", package = "qPCRtools")
cq.table <- data.table::fread(df1.path)
head(cq.table)
curve.table为标准曲线，可以通过前面介绍的方法计算得出。😂
df2.path = system.file("examples", "cal.expre.curve.sdc.txt", package = "qPCRtools")
curve.table = data.table::fread(df2.path)
head(curve.table)
design.table需要包含position和相应的信息，如干预、基因名等。 🙃
df3.path = system.file("examples", "cal.exp.curve.design.txt", package = "qPCRtools")
design.table = data.table::fread(df3.path)
head(design.table)
5.2 开始计算
CalExpCurve(
cq.table,
curve.table,
design.table,
correction = TRUE,
ref.gene = "OsUBQ",
stat.method = "t.test",
ref.group = "CK",
fig.type = "box",
fig.ncol = NULL) -> res
res[["table"]]
5.3 可视化
大家可以直接使用res[["figure"]]提取结果的可视化图，这里我为了更加美观，提取了数据进行美化。😘
res[["table"]] %>%
grouped_ggbetweenstats(y = expre,
x = Treatment,
grouping.var = Gene,
type = "nonparametric"
)
2-ΔΔCt法计算表达水平
数据准备与上面的方法相似，这里就不做具体介绍了。😂
6.1 示例数据
df1.path <- system.file("examples", "ddct.cq.txt", package = "qPCRtools")
cq.table <- data.table::fread(df1.path)
head(cq.table)
df2.path <- system.file("examples", "ddct.design.txt", package = "qPCRtools")
design.table <- data.table::fread(df2.path)
head(df.2)
6.2 开始计算
CalExp2ddCt(cq.table,
design.table,
ref.gene = "OsUBQ", ## 内参
ref.group = "CK", ## 对照
stat.method = "t.test", ## 统计方法
fig.type = "bar",
fig.ncol = NULL) -> res
res[["table"]]
6.3 可视化
res[["table"]] %>%
grouped_ggbetweenstats(y = expre,
x = Treatment,
grouping.var = gene,
type = "nonparametric"
)
使用RqPCR方法计算表达水平
这种方法也是一种不需要内参的计算方法，数据格式也是几乎一样的。
7.1 示例数据
df1.path <- system.file("examples", "cal.expre.rqpcr.cq.txt", package = "qPCRtools")
cq.table <- data.table::fread(df1.path, header = TRUE)
head(cq.table)
df2.path <- system.file("examples", "cal.expre.rqpcr.design.txt", package = "qPCRtools")
design.table <- data.table::fread(df2.path, header = TRUE)
head(design.table)
7.2 开始计算
CalExpRqPCR(cq.table,
design.table,
ref.gene = NULL,
ref.group = "CK",
stat.method = "t.test",
fig.type = "box",
fig.ncol = NULL
) -> res
res[["table"]]
7.3 可视化
res[["table"]] %>%
grouped_ggbetweenstats(y = Expre4Stat,
x = group,
grouping.var = gene,
type = "nonparametric"
)
引用
🌟 如何引用：👇
<font size=1>Li X, Wang Y, Li J, Mei X, Liu Y, Huang H. qPCRtools: An R package for qPCR data processing and visualization. Front Genet. 2022;13:1002704. Published 2022 Sep 13. doi:10.3389/fgene.2022.1002704</font>
<img src="https://upload-images.jianshu.io/upload_images/24475539-b51a7740af8c7645.png" alt="泡芙" style="zoom:25%;" />
<center>最后祝大家早日不卷!~</center>
点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰
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