Rab GTPases，是细胞内囊泡转运的关键调控因子，对于植物细胞极性的生长至关重要，Rab GTPase在拟南芥中一共存在57个成员，被分为8个不同的亚家族(A-H)，在先前的研究中，RabA和RabD的成员发现在花粉发育和花粉管生长的过程中发挥作用，例如RabA4d,主要定位在花粉管内倒三角的区域，并且对于花粉管的囊泡转运过程非常重要，一旦缺失，将会导致花粉管极性生长的缺陷(例如缓慢生长以及花粉管宽度增加)，这一家族的另外一个成员RabA4b，主要定位在根毛顶端并且常常用来标记花粉管内的囊泡。但是目前对于GTP酶其独特分布以及其在囊泡运输中的功能目前还不清晰。在真核生物中，阴离子的磷脂主要包括PIPs，PS，PA定位在细胞膜的磷脂双分子层上，此外这些阴离子磷脂也能够作为信号分子发挥作用，但是目前对于PS在花粉管内倒三角区内定位以及功能也不是很清晰。PS的独特分布依赖于P4-ATPases(P4-type ATPases),该酶的功能主要是能够将PC,PE,PS在细胞膜上翻转到另外一侧。因此该酶也被称为ALA(aminophospholipid ATPases),为了进一步了解花粉囊泡的倒三角定位以及PS的生物学功能，作者想要详细理解ALA的生物学功能。

     通过生物信息学分析，发现ALA1/3/6/7/9/12表达在花粉内，为了验证ALA成员中那些因子对于 囊泡运输比较重要，利用FM4-64去染或是YFP-RabA4b标记这些突变体花粉管的囊泡，发现ala3突变体顶端区域囊泡出现缺失。此外尽管ala3突变体内，胞质环流能够进行，但是顶端的流速有所下降。除此之外ala3突变体呈现出花粉管生长速度减少和花粉管宽度增加的表型，因此ALA3参与调控了花粉管内的囊泡运输和极性生长。互补实验发现，ALA3全长的蛋白的确能够恢复ala3突变体的表型，说明缺陷的确是由这个基因造成的。为了探究表型原因，作者使用了花粉管极性生长的抑制剂，brefeldin A (BFA, a vesicle trafficking inhibitor), wortmannin (Wort, a PI3K inhibitor) 和 latrunculin B (LatB, an actin depolymerization drug)，这三种抑制剂处理均导致WT和ala3突变体花粉管极性生长受到抑制，但是BFA处理时，ala3突变体较wt不敏感，因此ALA3主要参与调控了囊泡转运的过程。

ala突变体表型

     随后作者查看了ALA3的蛋白定位，发现主要定位在花粉管的顶端和亚顶端。仔细观察的话，可以看到ALA3-GFP与FM4-64在顶端以及胫区共定位，暗示着ALA3-GFP主要是在囊泡以及细胞膜上。此外还和其他其他细胞器的marker做了共定位，发现ALA3-GFP还定位在反式高尔基体网络，后高尔基体以及再循环内体，但是不在高尔基体和晚期内体。使用内膜的抑制剂发现ALA3-GFP信号发生改变，暗示着ALA3的极性定位也受到内膜运输的影响。

ALA3蛋白定位

     有趣的是，RabA4d的蛋白定位于ALA3类似，均在花粉管顶端的倒三角区域表达，并且在ala3 突变体中RabA4d的蛋白定位出现异常，暗示着ala3缺失导致的花粉管极性生长异常和RabA4d相关。于是作者构建了ala3 raba4d 双突突变体，发现双突突变体花粉管长度以及宽度与单突相似，暗示着这两个基因在同一条遗传通路上。此外他们还用FM4-64鉴定了raba4d 突变体材料发现，染色减少，并且花粉管的顶端膨大越大，染色越少。因此ALA3可能通过调控RabA4d调控花粉管的极性生长。

ALA3调控RabA4d

     先前ALA被报道具有翻转磷脂的功能，那么ala3的突变体表型可能是由于磷脂不正常定位造成的。PS主要定位在倒三角区的顶端以及亚顶端。此外PS还能够与FM4-64以及反式高尔基体网络，后高尔基体，内体的mark而共定位。但是在ala3突变体中，PS内花粉管的倒三角定位缺失。有趣的是PS整体的定位与RabA4b, RabD1相似，暗示着ALA3参与调控了PS的不对称分布，而PS反过来又能够调控Rab酶的功能。

ALA3调控PS的定位

      在ala3突变体当中所标记的囊泡数目减少，暗示着ALA3可能影响了TGN/EE处囊泡生成的过程。于是作者将ala3与多个细胞器的marker杂交，发现ER和Golgi的marker不受影响，但是TGN/EE处的maker，荧光强度减弱，暗示着ALA3调控的囊泡形成的过程。此外如果在ala3突变体中对YFP-RabA4b 和 mCherry-RabA1e形成光漂白，发现荧光恢复的速度要野生型man很多，说明ALA3处理调控囊泡的生成过程也调控囊泡的再循环过程。

ala3导致TGN/EE的不正常定位

      RabA4d介导的囊泡运输过程通常和细胞壁组分息息相关，于是作者检测了ala3突变体中细胞壁组分的变化，发现AGPs,xyloglucan，HG，成分发生明显下降，但是RG-I，high-methyl-esterified HG成分下降不明显，而胼胝质合成酶的活性未发生改变，而VGD1（参与由低HG到高HG）的表达量发生改变。因此ALA3影响了花粉管细胞壁组分转运，从而影响了花粉管的生长。

ala突变体细胞成分改变，

最后为了确定ALA3是否广泛的影响了内膜系统中GTP酶，作者观察了ala3中RabA1e 和 RabA1g（标记循环内体）蛋白定位的变化，发现表达量急剧下降并且极性定位也消失。而RabA5d表达量下降，但是定位却未发生改变，RabE1d 和 RabC1（标记后高尔基体），前者蛋白表达量减少，后者不受影响，而LE的marker（ARA6 和 RabG3f），前者密度减少但分布不变，后者分布和密度均改变。因此ALA3调控了多个GTP酶相关的内膜转运过程，但是具体机制却不同。

分泌性GTP酶的定位和活性

模型

     因此该文章发现ALA3参与调控PS的极性定位，而PS又可以通过影响GTP酶来影响囊泡数目和囊泡回收从而影响花粉管的极性生长。总体来说，这篇文章用到很多marker对于蛋白定位以及蛋白GFP信号的观察是值得好好学习。但是目前ALA家族其他成员是否冗余的调控这一过程以及PIPs,PA是否位于ALA3下游影响花粉管还不清楚，仍需进一步探究。