2020年的一篇circulation，做的也比较早了。
哺乳动物的心脏由多种细胞组成，细胞间也存在复杂的互通网络。虽然心肌细胞具有收缩功能，是心脏细胞的主要成分之一，但实际上心脏中非心肌细胞的数量更多。但不同细胞成分如何相互协调组成心脏整体结构，细胞的生态系统又是如何在生理刺激下逐渐改变，以及不同细胞类群在心肌损伤，衰老，高血压或肥胖状态下导致心脏功能减退的机制尚不清晰。另外，近几年研究表明生物学性别特征是影响心血管稳态和疾病的重要因素，但性别对慢性应激状态下各细胞类群的转录反应有何影响仍然未知。
这一篇做的是AngII诱导的心脏纤维化和肥厚模型
1. Isolation and analysis of the cardiac cellulome by scRNA-seq.
这一篇和文献学习035--[sc]单细胞测序揭示小鼠心脏非心肌细胞之间的异质性和互作是同一个通讯作者，两篇文章整个Fig 1的摆图和非心肌分选策略(CD31和CD45)以及雌雄小鼠各送一半以比较性别差异都差不多。
Fig 1A：为了同时得到心肌和非心肌，并且非心肌中尽可能多的的到非内皮细胞，作者对雌性和雄性小鼠心脏 (对照组和AngII2周组雌雄各4只) 进行了灌流。
心肌细胞：抽核（DAPI+流式分选对细胞核进行了纯化）
非心肌细胞：流式分选。分别的到CD31+CD45-内皮细胞和非内皮细胞 (CD31-CD45-基质细胞(主要是成纤维)和CD31-CD45+免疫细胞)
将内皮细胞，非内皮细胞和心肌细胞按照10%，75%，15%的比例混合送样。
这篇文章是
细胞和细胞核直接混合送的样？？
Fig 1B：取了其中一雌一雄小鼠心脏，一共7474细胞，做了注释，分为15种细胞
我不太理解，为什么不把所有的细胞拿来注释？Fig 1里先拿两个样品注释，Fig 2又放所有细胞的意义是什么？
Fig 1C-D：展示了一下每个细胞群的marker基因和top5高变基因
❗️BCD图的细胞群都对不上？C图里的DC-like cells哪来的？？？是文献学习035--[sc]单细胞测序揭示小鼠心脏非心肌细胞之间的异质性和互作这里的吗。。。
注释：
fibroblasts:Pdgfra,Col1a1(包括一群Fibroblast-Wif1)
pericytes:Pdgfrb,Vtn
smooth muscle cells:Acta2,Myh11
Schwann cells:Plp1,Kcna1
endothelial cells:Pecam,Ly6c1
macrophages:Fcgr1,Csf1r
其他免疫细胞： 粒细胞, B, T和NK（文章里没写marker基因，可以参考下面c图）
CMs:Ttn,Myh6
epicardial cells:Msln,Upk3b
lymphatic endothelial cells:Lyve1,Cldn5
endocardial cells:Npr3,Cytl1
2. Histological and cellular changes in the heart after induction of cardiac fibrosis.
Fig 2A-C：分组：对照和AngII两周（雌雄每组各四只），雌性和雄性造模组小鼠均出现明显心脏扩大和纤维化增加。
Fig 2D：一共得到29558个细胞，做了注释。(又有数字命名的，又有基因命名的，好乱啊)
Fig 2E, F：给予AngII后，一些细胞群的比例出现了显著变化，如Fibroblast-Cilp和Fibroblast-Thbs4、淋巴管内皮细胞比例显著增加，施万细胞比例则出现了下降。
作者还对细胞比例做了流式检测，放在附件里
3. Gene expression changes in cardiac cell populations.
Fig 3A：棒棒糖图展示了AngII治疗在所有的细胞群中都引起了转录改变，其中成纤维细胞展示出最多的差异基因变化，巨噬和内皮细胞亚群也显示出了高反应性。
Fig 3B：展示了每个细胞群top10的上调基因。可以看到一些基因如Cilp, Comp, Crlf1, Postn和Thbs4，在大多数细胞群都出现了显著上调（横着一排的圈圈都很大，FC在各个细胞群都很高）。尽管如此，这些基因只有在一些特定的细胞群中的表达比较高，在其他细胞群中表达量则相对较低。这些基因中有一些在此前的心衰相关研究中被报道过。
Fig 3C：做了每个细胞群上调基因的通路富集，每个群使用桑基图展示了top3通路。结果显示多数的心脏细胞群参与了remodeling of the cardiac ECM。
这个B图和C图画的也太好看了吧，有时间做一下复现。
4. Distinguishing features of fibrosis-associated fibroblasts.
在前面Fig 2F里面提到了Fibroblast-Cilp和Fibroblast-Thbs4在AngII治疗后出现了最明显的比例变化。因此作者随后探究了这两群细胞对心脏重塑的作用。
Fig 4A-C：Fibroblast-Cilp和Fibroblast-Thbs4这两群细胞和其他所有细胞/其他control组成纤维细胞/其他AngII组成纤维细胞的差异和富集分析。目的是探究这两群细胞的共有特征。和其他所有细胞相比，这两群细胞富集到的通路主要与成纤维细胞的基础功能有关（如collagen and ECM organization）。而在和其他control组成纤维细胞/其他AngII组成纤维细胞相比时，这两群细胞的显著特征主要与collagen-remodeling有关。
Fig 4D：Fibroblast-Cilp和Fibroblast-Thbs4这两群细胞间的差异和富集分析提示Fibroblast-Cilp比Fibroblast-Thbs4有更高的ECM-remodeling genes表达。
A-D的左图可以很直观的展示是哪些细胞群之间的比较，之前没见到过这种画法。用
PS的描边功能应该可以实现，有空的时候试一试。
Fig 4E：作者计算了三条ECM-remodeling相关通路的基因的转录本在不同成纤维细胞群中的计数。结果显示Fibroblast-Cilp和Fibroblast-Thbs4这两群细胞are key contributors to ECM remodeling（？？？Fibroblast-Thbs4的转录本明明很低啊）。其中Fibroblast-Cilp群的ECM-remodeling相关基因转录本丰度最高。
Fig 4F：展示了Fibroblast-Cilp和Fibroblast-Thbs4这两群细胞比较时各自的top10差异基因（结果来自前面的D图）。Fibroblast-Thbs4显著高表达Thbs4, Fmod, Cthrc1和Cilp2，这些基因在Fibroblast-Cilp的表达较低。但相反，在Fibroblast-Cilp中高表达的基因，在Fibroblast-Thbs4中表达百分比也比较高（没法通过染色鉴定Fibroblast-Cilp）。
Fig 4G：通过THBS4染色鉴定Fibroblast-Thbs4群(WGA染心肌细胞膜)。结果显示Fibroblast-Thbs4群的同时存在局灶分布(ii)和分散分布(ii')。在围血管的纤维化(iii)中没有见到Fibroblast-Thbs4细胞(iii')提示Fibroblast-Thbs4细胞主要参与间质纤维化而不是围血管纤维化。
Fig 4H-I：既往认为，参与心脏纤维化的主要是ACTA2+ myofibroblasts(ACTA2就是aSMA)。因此作者查看了Acta2在细胞中的表达，发现Fibroblast-Cilp和Fibroblast-Thbs4这两群细胞都不是ACTA2+ myofibroblasts。
Fibroblast-Cilp和Fibroblast-Thbs4在转录上可能更像此前报道过的matrifibrocyte(a specialized fibroblast state found in the mature scar after myocardial infarction1)。一些matrifibrocyte的marker基因如Comp, Sfrp2和Wisp2也在这两群细胞中表达。
J Clin Invest. 2018;128:2127–2143.
5. Shifts in fibroblast cell state in response to chronic stress imposed by AngII treatment.
Fig 5A：为了探究Fibroblast-Cilp和Fibroblast-Thbs4这两群细胞的起源，作者对所有成纤维细胞群进行了速率分析。结果提示Fibroblast-Thbs4是由Fibroblast-Cilp分化而来，而Fibroblast-Cilp则来源于Fibroblast5和Fibroblast6。
Fibroblast5/6 --> Fibroblast-Cilp --> Fibroblast-Thbs4的分化轨迹也可以解释前面Fig4里面Fibroblast-Cilp的高变基因在Fibroblast-Thbs4中也表达。
Fig 5B-C：一些基因比如Cilp和Postn在两群细胞中都表达，但是存在沿着分化轨迹的表达梯度变化。提示Fibroblast-Thbs4细胞代表了一种以特定基因群转录活化为特征的细胞状态。
Monocle和Slingshot也是类似的轨迹
6. Intercellular connection network of the cardiac cellulome.
为了探究AngII治疗对心脏细胞间信号交流的影响，作者对各细胞群进行了细胞互作分析。
Fig 6A：所有细胞的互作。结果显示成纤维细胞信号为心肌间质微环境主要特征(最多互作，3000多条)，其次是巨噬细胞(2000多条)。此外，树突状细胞，心外膜细胞以及心内膜细胞也与其他细胞有着紧密的胞间信号通讯，相比之下，粒细胞，杀伤性细胞和淋巴细胞(patrolling cell populations)与其他细胞通讯较少。
Fig 6B：检测特定细胞群的关键分子有助于分析细胞间相互作用(Relative expression of a selection of essential growth factors across major cardiac cell types)。例如，心外膜细胞高表达Csf1，其显著影响巨噬细胞活力，而主要产生于心肌细胞的Vegfa促进着内皮细胞的生长。心外膜细胞可通过Csf1/Csf1r通路促进巨噬细胞功能。
Fig 6C：巨噬细胞亚群的空间分布也与心外膜相关，这说明心外膜及心外膜下区域可能营造了巨噬细胞相关生长环境。
Fig 6D：AngII组小鼠所有细胞类型的互作和对照相比都增加，以成纤维增加的最显著。
Fig 6E, F：随后作者对upregulated connections between cell types做了GO分析。结果显示，AngII作用后，强化的细胞间通讯主要与氨基酸刺激和胶原纤维排布相关，表达上调的受体与细胞外基质重构相关，血管生成相关的配体也在多种细胞类群中上调。
以上结果表明，心肌细胞组中多种细胞协同促进心脏微环境中细胞外基质的重构。
7. Sexual dimorphic remodeling and cellular responses.
随后作者比较了性别间的差异
Fig 7A：作者发现心脏特定解剖位置的纤维化程度在不同性别间有显著差异。
Fig 7B, C：为研究性别特异性基因表达模式的细胞差异，研究者分别从不同性别的对照组和血管紧张素刺激组小鼠心肌中分离细胞，但并未发现除Fibroblast-Thbs4亚群外，对照组与实验组相比细胞类群有性别相关差异。
Fig 7D, E：但在两组内，各细胞类群存在高度性别相关性基因表达差异，其中在对照组成纤维细胞第2亚群，4-6亚群以及实验组2-6亚群和Clip亚群中性别显著影响细胞的基因表达。血管紧张素刺激后，存在性别差异的上调基因主要表达于成纤维细胞中。
Fig 7F：Vegfa基因在血管紧张素刺激组雄性小鼠心肌细胞和Thbs4成纤维细胞中表达，而雌性小鼠细胞外基质重构相关基因表达在成纤维细胞第6亚群以及Clip亚群中上调明显。
最后，为研究Clip成纤维细胞和Thbs4成纤维细胞是否参与人类心肌病理性重构，研究者分析了85名女性和172名男性的心肌RNA测序结果，以NPPB高表达粗略评估可能的心肌肥厚情况。结果表明，POSTN,TGFβ1和胶原在肥厚组中显著升高，而小鼠Clip和Thbs4成纤维细胞亚群中高表达的基因也在人类肥厚组心脏中高表达。
本研究鉴定出促进心肌纤维化的新型细胞及相关基因，并揭示了生理或慢性应激状态下心肌细胞类群的转录组学特征受到性别影响，为未来治疗心肌纤维化的进展提供了细胞及分子靶点。同时也为未来正常及慢性应激状态的心脏细胞学研究提供了价值丰富的数据资源，为哺乳动物病理性心肌重构的细胞学和病理学机制提供了新见解。
1. Fu X, Khalil H, Kanisicak O, Boyer JG, Vagnozzi RJ, Maliken BD, Sargent MA, Prasad V, Valiente-Alandi I, Blaxall BC, et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. J Clin Invest. 2018;128:2127–2143. doi: 10.1172/JCI98215
